论文部分内容阅读
抗生素菌渣是抗生素制药企业在生产发酵类抗生素过程中产生的固体废弃物,富含蛋白质、有机质及有机酸,是一种潜在的可回收资源,但因含有抗生素残留及其代谢产物而被我国列为危险废物。对其不合理的处理处置极易造成周围环境的生态危害和污染,因此有必要对其处理处置方式开展环境安全评价。本文采用分析化学和分子生物学方法,基于青霉素对土壤微生物群落的影响、菌渣饲料对小鼠肠道微生物分布的影响以及菌渣与市政污水处理厂剩余污泥混合填埋对环境微生物多样性的影响研究,探讨并初步评价抗生素菌渣的饲料化利用和混合填埋两种处置方法的微生物生态安全性。在土壤中添加浓度为0、2、20、200.400、800mg/kg的青霉素后,分别于第0、3、7天取样分析土壤中青霉素残留及微生物多样性,结果发现,1天后各组土壤中青霉素降解率均达50%以上,3天后各组样品均检测不出青霉素残留；经Biolog-Eco法检测发现,0、2、20、200mg/kg处理组中的土壤微生物对碳源的代谢无明显差异,但400.800mg/kg处理组土壤微生物的碳源代谢发生明显改变,以酚酸类化合物(Phenolic acids)为碳源的微生物成为优势菌群；但基于碳源的平均利用率(AWCD值)变化分析,不同浓度青霉素的添加对土壤微生物总体活性影响较小。PCR-DGGE指纹图谱分析发现,与Omg/kg处理组相比,800mg/kg青霉素处理组第3天时的Shannon多样性指数显著降低(P<0.05),但第7天时各处理组Shannon多样性指数无显著差异。对PCR-DGGE指纹图谱中优势条带的16S rDNA片段测序分析表明,与土壤中的青霉素抗性菌Burkholderiales bacterium相似的16S rDNA片段在0、3、7的6个处理组中均存在；与青霉素抗性菌Sphingomonas roseiflava相似的16S rDNA片段仅在添加有青霉素的5个试验组第7天时的样品中有发现；与对青霉素敏感的Bacillus niabensis.Agromyces lapidis相似的16S rDNA片段第3、7天时在青霉素浓度为0、2mg/kg的处理组有发现,但在青霉素浓度>2mg/kg的处理组未发现。因此,青霉素胁迫对土壤微生物多样性有一定的抑制作用,青霉素的选择压力可促进土壤中低丰度的青霉素抗性菌的增加并可能使其成为优势菌群。当青霉素菌渣经冷冻干燥后(青霉素残留量2.38±0.13mg/g)与商业成品饲料按质量比1：99(处理组1)、3：97(处理组2)、0：100(处理组3)混匀后分别饲喂小鼠30、60、90天后,分析青霉素在小鼠肝脏及粪便中的残留量以及小鼠肠道微生物的变化。结果发现,不同时间点及不同处理组的小鼠肝脏、粪便中均无青霉素残留；对小鼠肠道微生物的PCR-DGGE指纹图聚类分析显示,不同时间点三个处理组小鼠肠道微生物菌群结构差异较大；对PCR-DGGE指纹图谱中优势条带的16S rDNA片段测序分析表明,第2组第30和90天的特异性条带的测序结果中分别含有与青霉素抗性菌Akkermansia muciniphila和Roseburia hominis16S rDNA片段序列相似性较高的DNA片段；第3组第30天和90天的特异性条带的测序结果中均含有与青霉素敏感菌Robinsoniellapeoriensis 16S rDNA片段序列相似性极高的DNA片段。因此,青霉素菌渣饲料喂养小鼠后,小鼠体内虽无青霉素残留,但菌渣饲料对小鼠肠道微生物群落结构会产生较大影响,青霉素的选择压力可促进肠道内低丰度的青霉素抗性菌的增加并可能成为优势菌群。将青霉素菌渣(青霉素残留量1.09±0.58mg/g)与市政污水处理厂二沉池剩余污泥按质量比0：1(处理组1)、1：2(处理组2)和1：1(处理组3)混合填埋,分析0、3、7、20、60天后填埋样品中青霉素残留量及微生物多样性的变化。结果发现,第7天时各样品中均检测不出青霉素残留；对填埋样品的PCR-DGGE指纹图谱分析发现,不同处理组的微生物多样性都表现出随时间先减少再增加的趋势；对PCR-DGGE指纹图谱中优势条带的16S rDNA片段测序分析表明,与处理组1相比,菌渣与污泥混合填埋处理时,第3天的样品中发现与可将复杂大分子聚合物水解、酸化为单体或小分子聚合物的Megasphaera elsdenii、Lactobacillus curvatus16S rDNA片段序列相似的DNA片段,第7天样品中发现与可利用小分子有机物或单体发酵产生甲酸、乙酸、H2、CO2等小分子化合物的Clostridium jejuense、Sporanaerobacter acetigenes、Peptostreptococcus russellii Peptostreptococcus anaerobius16S rDNA片段序列相似的DNA片段。第20天的填埋样品DGGE指纹图谱中优势条带的16S rDNA片段测序分析结果与第7天基本相同,第60天的填埋样品DGGE旨纹图谱中优势条带的16S rDNA片段测序分析结果基本为未培养微生物。因此,将菌渣与污泥混合填埋,可加快青霉素及有机物的降解,促进填埋体内功能微生物菌群的结构演变以及微生物多样性增加。综述所述,青霉素菌渣的饲料化及与市政污泥的混合填埋处理均不会造成青霉素在动物体内或环境介质中的长期残留,但均会对动物体内及环境介质中微生物多样性与结构产生一定的潜在影响,主要表现为青霉素抗性菌丰度的增加以及土族微生物群落结构的改变。后续仍需进一步深入细化分析青霉素菌渣的资源化处置方式对生态环境和动物安全性的综合影响。