铁是生物体不可缺少的微量元素,在多种生理活动中都发挥着重要作用,然而铁过剩不仅会刺激机体产生有害的自由基,还会利于体内病原微生物的增殖。因此,维持机体铁稳态至关重要,其中铁蛋白(Ferritin,FT)和转铁蛋白(Transferrin,TF)分别作为铁储存和转运蛋白而发挥着关键作用。一直以来,铁是细菌和宿主争夺营养源的核心,许多铁代谢相关基因都会参与宿主的先天性免疫反应。近年来,铁代谢通路的免疫功能研究越来越受关注,相关报道也逐渐增多。团头鲂(Megalobrama amblycephala)作为我国的一种大宗淡水鱼类,近年来由于集约化养殖和环境恶化等原因导致多种病害频发,其中以嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)感染引发的细菌性败血症尤为严重。本研究以团头鲂为研究对象,对其Ft(M.amblycephala ferritins,MamFers)和Tf(M.amblycephala transferrin,MamTf)基因进行了克隆、表达及重组蛋白活性检测,并在L8824细胞上过表达后进行数字表达谱测序及差异基因筛选,最后实验验证了MamFers和MamTf对铁代谢和免疫通路的调控作用,旨在探索MamFers和MamTf基因在铁代谢和免疫应答过程中发挥的作用,为鱼类细菌性疾病的预防和治疗及抗病育种提供理论依据。本文主要研究结果如下:1.本研究克隆鉴定了团头鲂Ft基因两个亚基(M.amblycephala ferritin H and M subunits,MamFerH和MamFerM),序列分析表明这两个亚基都含有哺乳动物铁蛋白H亚基的铁氧化酶活性中心结构,而且Mam FerM还含有哺乳动物铁蛋白L亚基的成核作用位点。MamFerH和MamFerM的5非编码区(5’-Untranslated Regions,5’-UTR)都含有铁反应元件(Iron Responsive Element,IRE)元件,但预测的二级结构存在差异。序列比对分析表明MamFerH和MamFerM间的同源性仅有65%,并且进化分析表明铁蛋白H和M亚基分别聚为一支,表明两者由不同的基因编码而成。MamFerH和MamFerM具有类似的早期发育表达模式,都在出膜后表达上调。然而,MamFerH和MamFerM具有不同的组织表达模式,MamFerH主要表达于血液和脑,而MamFerM则在脾脏、肝脏和肾脏中高表达。嗜水气单胞菌感染后,MamFerH和MamFerM在mRNA和蛋白水平都能被诱导而显著上调表达,免疫组化和免疫荧光分析表明感染后两者在细胞质和细胞核上的分布都会显著增强,其中MamFerH具有更快速和更显著的急性期反应。相比之下,重组MamFerH蛋白也表现出更有效的抑菌作用,而重组MamFerM蛋白则具有更有效的铁结合活性。2.本研究还克隆了MamTf基因,Mam Tf蛋白由两个同源结构域(N端和C端)组成,每个结构域都含有4个铁离子结合位点。MamTf在团头鲂肝脏中特异性高表达,表达水平显著高于其他组织。发育期表达分析显示MamTf在12 hpf(hours post fertilization)开始表达并逐渐上调,随后在出膜期(32 hpf)显著下调,出膜后在2 dph(days post hatching)显著上调并达到最大值。嗜水气单胞菌感染后MamTf及其受体1在团头鲂肝、脾、肾3个组织中的mRNA和蛋白表达水平都被诱导上调。普鲁士蓝染色显示感染后肝细胞内的铁含量显著增多,免疫组化分析表明感染后MamTf及其受体1在肝细胞膜和胞内分布增多,表明两者可能通过内在化将铁离子转运至胞内,致使团头鲂肝细胞内铁含量上调。重组MamTf蛋白的铁结合活性呈现出浓度依赖性上升方式,并且体外实验表明添加重组MamTf蛋白可以在一定程度上抑制嗜水气单胞菌的增殖。3.为进一步研究MamFers和MamTf基因的转录调控作用,本研究在L8824细胞中过表达MamFerH、MamFerM和MamTf后进行数字表达谱测序。比较数字表达谱分析表明MamFerH和MamFerM的下游调控通路包括免疫系统及抗菌反应,qRT-PCR(Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction)验证表明MamFers和MamTf过表达后分别能诱导TNFα(Tumor Necrosis Factor alpha)和iNOS(Inducible Nitric Oxide Synthase)基因表达上调。NFκB(Nuclear FactorκB)作为一种重要的转录调控因子,广泛参与机体免疫应答,包括对多种细胞因子的表达调控作用。本研究发现MamFers和MamTf过表达后能促进NFκB的转录活性及pIKK蛋白磷酸化水平的上调。添加BAY11-7082(IκBα抑制剂)会显著抑制MamFers和MamTf过表达后对细胞因子的诱导表达作用。此外,本研究发现MamFers和MamTf过表达后也能显著上调MAPK(Mitogen-activated Protein Kinase)蛋白的磷酸化水平,添加U0126(MEK1/2抑制剂)会显著抑制MamFers和MamTf过表达后对促炎细胞因子的诱导表达作用。上述结果表明,MAPK和NFκB能介导MamFers和MamTf对促炎细胞因子的表达调控。4.本研究发现MamFers和MamTf过表达会抑制嗜水气单胞菌Ah对EPC细胞的粘附,而干扰后会促进Ah的粘附过程。qRT-PCR分析表明MamFers和MamTf过表达后ECM(Extracellular Matrixc)相关基因fibronectin(FN)和Integrin beta 1(Intgβ1)表达都会被调控。然而两者具有截然相反地调控方式,MamFers和MamTf过表达后FN表达上调而Intgβ1下调,MamFers和MamTf干扰后表达趋势相反。进一步研究表明,FN和Intgβ1都参与了介导MamFers和MamTf对Ah粘附过程的调控。5.本研究发现MamFers和MamTf过表达会促进NLRC5(NOD-like Receptor Family CARD Domain Containing 5)、β2M(β2 Microglobulin)和MHC I(Major Histocompatibility Complex Class I)表达上调。本研究将si RNA-NLRC5与MamFers和MamTf过表达质粒共转染后可以显著抑制MamFers和MamTf对β2M/MHC I表达的诱导作用,表明MamFers和MamTf可以通过NLRC5调控β2M/MHC I的表达。此外,MamFers和MamTf过表达会显著促进hepcidin基因表达上调,而siRNA-β2M与MamFers和MamTf过表达质粒共转染可以抑制这种诱导作用,根据上述结果可以推测MamFers和MamTf过表达后先调控NLRC5,再通过NLRC5调控β2M表达,最后通过β2M对hepcidin基因进行调控。