防御假单胞菌(Pseudomonas protegens)是一种具备生防功能的环境微生物,其宿主种类多样,普遍存在于土壤、植物、水体等自然环境中。防御假单胞菌SN15-2通过分泌多种类抗生素来抑制病原菌的生长,根际高效定殖能力和分泌噬铁素的功能也是该菌发挥生防能力的重要原因。但是SN15-2在实际应用中的瓶颈问题是抗逆境能力差,高温条件下容易失活,且制剂货架期短。目前对SN15-2面对逆境环境的调控机理研究较少,因此探索防御假单胞菌面对逆境时的调节机制具有重要的学术价值和现实意义。本研究对SN15-2进行全基因组测序和分析,发现该菌含有6433个蛋白编码基因(占全基因组的88.31%),208种非编码RNA,tRNA有71个,16条微卫星DNA和14条CRISPR序列。防御假单胞菌SN15-2基因组的6433个蛋白编码基因中,分别有5210、3259、5277个基因在COG、KEGG、GO数据库中得到注释。通过建立蛋白进化发育树发现SN15-2中的SpoT蛋白中存在多个保守的氨基酸序列,这几个保守残基在很大程度上影响蛋白酶的活性。SpoT蛋白与荧光假单胞菌和铜绿假单胞菌中的同源蛋白之间的同源性分别达到99.57%、90.46%。然后,通过无痕基因敲除技术成功构建了防御假单胞菌SN15-2中介导严谨反应的spoT基因缺失突变菌株ΔspoT。并研究发现spoT对生长速率并没有影响,也不参与青枯劳尔氏菌的拮抗作用,但能够调控SN15-2的泳动能力、高温耐受性和酸胁迫耐受性。在泳动能力检测平板上ΔspoT菌株的泳动能力总是强于野生菌株,二者泳动圈直径之间具有显著差异。450mmol盐胁迫环境培养6小时后,野生菌株的存活率为突变菌株的4.58倍,二者表现出明显的差异(p<0.05);45℃高温胁迫2小时后,野生菌株的生存率为ΔspoT的57.83倍;而在碱性环境中,二者并没有显著的差异。可见,spoT介导的严谨反应响应细菌的压力应答,推测spoT可能参与防御假单胞菌SN15-2中抵抗高温、高渗压力的相关基因调控。最后,通过HPLC分析和RT-PCR技术等研究spoT基因缺失后对菌株的生物膜形成、群体感应信号分子、生物膜合成相关基因表达的影响,发现野生菌的合成生物膜的能力明显强于缺失菌株,在培养6小时和24小时时,SN15-2和ΔspoT的生物膜量具有极显著的差异(p<0.01),spoT介导的严谨反应对菌株生物膜合成具有正向调节作用。对群体感应信号分子(AHLs)的检测显示缺失spoT后C8-HSL与C10-HSL显著减少。ΔspoT在培养12h时,与生物膜合成有关的8个基因均出现下调,其中csrA、wepI、hcp1、anoR等四个基因分别下降了 4.51倍、9.35倍、25.4倍和24.8倍。可见,spoT基因不仅调控菌株的生物膜,还能调控群体感应信号分子的合成,并通过下调hcp1、anoR、qseC和luxQ等多个基因的表达调节群体感应和生物膜的形成。因此,spoT在SN15-2中维持生物膜形成、抗逆境能力和群体感应机制正常运转具有重要作用,揭示了作为全局调控机制的严谨反应对SN15-2生理活动的调节作用。论文基于基因组学和生物信息学技术分析揭示了防御假单胞菌SN15-2中SpoT蛋白的进化发育情况和保守序列。通过采用无痕基因敲除技术等系统的研究,发现了由spoT介导的严谨反应可有效调控SN15-2的泳动能力、高温耐受性和酸胁迫耐受性。通过HPLC和RT-PCR技术分析,揭示了 SN15-2中严谨反应、生物膜形成和群体感应之间的调控机理。丰富了严谨反应调控生物膜形成和群体感应信号分子合成的理论,为防御假单胞菌SN15-2的抗逆机制研究和菌株的应用奠定理论基础。