异淀粉酶（Isoamylase）是淀粉脱支酶中的一种,它能够催化支链淀粉、糖原及某些分支糊精中的a-1,6糖苷键的断裂反应。由于在淀粉质原料中含有75-80%的支链淀粉,一般的a-淀粉酶、β-淀粉酶等只能够水解直链淀粉中的a-1,4-糖苷键,因此,异淀粉酶特别是高温异淀粉酶在提高淀粉原料利用率及产品质量等方面有很高的实用价值。异淀粉酶广泛存在于微生物界,现已知产异淀粉酶的微生物有细菌和真菌两大类,异淀粉酶不仅可以应用于淀粉的深加工工业,而且在食品、医药、包装等行业也有巨大的应用潜力。 本研究从云南省腾冲、梁河及洱源等地采集高温热泉水样,通过分离纯化得到48株非芽孢菌,经平板初筛,从中筛选出26株产淀粉脱支酶的菌株,经液体培养基复筛,筛选出16株产胞外淀粉脱支酶活性较高的菌株,通过传代培养,最终筛选到2株产淀粉脱支酶较为稳定的菌株ZZC6-6、CK1-2-4。其中ZZC6-6产酶较高,较稳定。 根据形态及生理生化特征初步鉴定ZZC6-6为栖热菌属（Thermus）的菌株。同时,通过比较a-淀粉酶和ZZC6-6所产淀粉脱支酶分别对相同底物（包括可溶性淀粉、可溶性支链淀粉、可溶性直链淀粉及普鲁兰糖）的不同作用结果,确定ZZC6-6所产酶是一种异淀粉酶。 通过诱导和诱变ZZC6-6,使ZZC6-6菌株产淀粉脱支酶酶活力由初始4.14u/mL提高到18.54u/mL。高于国内报道的地衣芽孢杆菌所产酶活7.37u/mL。通过二次正交组合实验研究得出了优化后的产酶发酵条件和培养基组成,即温度60℃、pH值6.8、支链淀粉2.87g/L、酵母粉0.86g/L、蛋白胨0.73g/L。 通过硫酸铵盐析,阴离子交换柱层析和凝胶柱层析纯化,纯化后的ZZC6-6异淀粉酶经电泳检测为单一条带,纯化倍数9.9,比活力91.38u/mg,分子量约为41KDa。 酶学性质研究表明ZZC6-6所产异淀粉酶最适作用温度为75℃,最适pH值8.0。该酶热稳定性高,在70℃水浴中处理30min后仍保留70%的活性。Na⁺,Mg²⁺,Ca²⁺,Cr³⁺对ZZC6-6异淀粉酶有激活作用,其中Na⁺激活作用最强,可使酶活提高114%,Cu²⁺,Zn²⁺,Co²⁺对该酶有较强的抑制作用。