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研究目的：BMP9是TGFbeta信号超家族的一个配体，作为最有效的成骨诱导因子之一。本研究通过构建19个碱基长度的随机RNA片段文库，使用BMP9诱导间充质干细胞分化，进行体内体外筛选。通过筛选获得富集的19ntRNA片段，进一步分析这些片段的模式。提出成骨分化过程中miRNA作用的机制，为后续研究骨骼系统疾病的早期诊断、治疗提供理论支持。同时我们实验室前期的研究表明BMP9和其他BMPs类似，参与了组织、器官发育和肿瘤发生中的重要作用。我们使用C57BL/6J小鼠，通过研究BMP9及其信号通路中的ALK1、ALK2、SMAD6、SMAD7、Noggin，在不同年龄不同组织中的转录水平，进一步系统性的揭示BMP9信号通路的表达规律。
方法：
(1)通过化学合成随机排列的19个碱基DNA片段，将该片段克隆到pSLOK质粒中。通过电转将pSLOK质粒转入大肠杆菌，扩增培养大肠杆菌后提取质粒。以pSLOK质粒作为包装逆转录病毒的骨架，和逆转录包装质粒pCL-Ampho共转染至293PA细胞，包装逆转录病毒。收集含逆转录病毒的上清液，使用逆转录病毒感染间充质干细胞系(BMSC-TA为永生化的骨髓间充质来源的干细胞，iMADs为脂肪来源的干细胞)。通过BSD筛选，成功获得含有19ntRNA文库的细胞群。
(2)体外筛选：通过体外培养间充质干细胞，加入AdBMP9感染间充质干细胞，使其扩增传代。多次传代后，大量MSCs进行成骨分化，收集剩余细胞。
(3)体内筛选：经历3周的体外筛选，收集剩余的MSCs细胞，注射于裸鼠皮下，约2周左右，收集皮下包块。
(4)通过切碎包块、胰酶消化、细胞提取、培养，获得抗分化的间充质干细胞群。再次使用AdBMP9作为生长因子，促进细胞分化，重复以上体内体外培养的步骤为一个循环。每一轮细胞群命名为A、B、C、D、E。经过体内体外筛选，获得不同阶段的抗分化细胞群。
(5)通过对每一轮筛选的间充质干细胞进行基因组DNA抽提，进行测序。得到富集的19ntRNA片段序列，进行生物信息学分析。
(6)PubMed网站查询MouseENCODE项目中PRJNA66167数据集，将BMP9信号通路中BMP9、ALK1、ALK2、SMAD6、SMAD7、Noggin蛋白转录RNA的表达水平进行下载，分析。数据集包括30种来源于小鼠的胚胎和成体组织。
(7)收集新生鼠，2周龄，4周龄，3月龄，8月龄，18月龄雌性C57BL/6J小鼠的主要组织标本。从小鼠组织中提取总RNA并逆转录，采用TouchDownqRT-PCR的方法分析小鼠不同年龄段的组织中BMP9及相关信号分子的表达。
结果：
(1)通过pSLOK质粒成功构建含有19个随机碱基的小RNA文库，感染间充质干细胞，经过体内体外多轮筛选，得到抗分化的细胞群。
(2)进行体内体外诱导分化实验证实抗分化细胞群与正常间充质干细胞群的差异。
(3)对本研究构建的19ntRNA文库富集序列进行pubmed、ensembl数据库匹配，表明19ntRNA文库富集的片段几乎没有完全匹配基因组位点，提示富集的19ntRNA片段的作用方式可能不符合siRNA作用机制。
(4)对同一种MSCs不同筛选阶段的细胞群进行分析，19ntRNA片段的富集程度随着筛选的进行而增加；对不同的MSCs，利用19ntRNA筛选，有重复序列；最先富集的RNA片段碱基序列，从2-7位碱基开始出现，具有高度的相似性，符合miRNAseeds作用机制。
(5)对同一种MSCs不同筛选阶段的细胞群进行分析，富集的19ntRNA序列2-7位碱基具有高度重复性；对不同的MSCs，富集的2-7位碱基具有重复。
(6)小鼠ENCODE转录组数据表明BMP9在肝脏中高表达，而BMP9相关的BMPI型受体ALK1在肺中高表达。
(7)BMP9在骨骼发育期仅以中等至低水平表达，在产后肝和肺组织中高表达。
(8)ALK1和ALK2在骨骼发育期表达含量逐步升高。ALK1在肺中高表达，而ALK2在脂肪和肾脏组织中表达相对较高。
(9)BMP9信号的负调控因子Smad6，Smad7和Noggin在小鼠出生后组织中广泛表达。
结论：
(1)使用BMP9诱导间充质干细胞分化，19ntRNA文库进行抗分化筛选，能获得具有一定抗分化特征的细胞群。
(2)富集的19ntRNA文库片段，具有规律性，具体发挥作用的机制可能和miRNASEEDs作用机制有关。
(3)BMP9及相关受体ALK1、ALK2在小鼠骨骼发育期表达逐渐增高，可能发挥重要作用。
方法：
(1)通过化学合成随机排列的19个碱基DNA片段，将该片段克隆到pSLOK质粒中。通过电转将pSLOK质粒转入大肠杆菌，扩增培养大肠杆菌后提取质粒。以pSLOK质粒作为包装逆转录病毒的骨架，和逆转录包装质粒pCL-Ampho共转染至293PA细胞，包装逆转录病毒。收集含逆转录病毒的上清液，使用逆转录病毒感染间充质干细胞系(BMSC-TA为永生化的骨髓间充质来源的干细胞，iMADs为脂肪来源的干细胞)。通过BSD筛选，成功获得含有19ntRNA文库的细胞群。
(2)体外筛选：通过体外培养间充质干细胞，加入AdBMP9感染间充质干细胞，使其扩增传代。多次传代后，大量MSCs进行成骨分化，收集剩余细胞。
(3)体内筛选：经历3周的体外筛选，收集剩余的MSCs细胞，注射于裸鼠皮下，约2周左右，收集皮下包块。
(4)通过切碎包块、胰酶消化、细胞提取、培养，获得抗分化的间充质干细胞群。再次使用AdBMP9作为生长因子，促进细胞分化，重复以上体内体外培养的步骤为一个循环。每一轮细胞群命名为A、B、C、D、E。经过体内体外筛选，获得不同阶段的抗分化细胞群。
(5)通过对每一轮筛选的间充质干细胞进行基因组DNA抽提，进行测序。得到富集的19ntRNA片段序列，进行生物信息学分析。
(6)PubMed网站查询MouseENCODE项目中PRJNA66167数据集，将BMP9信号通路中BMP9、ALK1、ALK2、SMAD6、SMAD7、Noggin蛋白转录RNA的表达水平进行下载，分析。数据集包括30种来源于小鼠的胚胎和成体组织。
(7)收集新生鼠，2周龄，4周龄，3月龄，8月龄，18月龄雌性C57BL/6J小鼠的主要组织标本。从小鼠组织中提取总RNA并逆转录，采用TouchDownqRT-PCR的方法分析小鼠不同年龄段的组织中BMP9及相关信号分子的表达。
结果：
(1)通过pSLOK质粒成功构建含有19个随机碱基的小RNA文库，感染间充质干细胞，经过体内体外多轮筛选，得到抗分化的细胞群。
(2)进行体内体外诱导分化实验证实抗分化细胞群与正常间充质干细胞群的差异。
(3)对本研究构建的19ntRNA文库富集序列进行pubmed、ensembl数据库匹配，表明19ntRNA文库富集的片段几乎没有完全匹配基因组位点，提示富集的19ntRNA片段的作用方式可能不符合siRNA作用机制。
(4)对同一种MSCs不同筛选阶段的细胞群进行分析，19ntRNA片段的富集程度随着筛选的进行而增加；对不同的MSCs，利用19ntRNA筛选，有重复序列；最先富集的RNA片段碱基序列，从2-7位碱基开始出现，具有高度的相似性，符合miRNAseeds作用机制。
(5)对同一种MSCs不同筛选阶段的细胞群进行分析，富集的19ntRNA序列2-7位碱基具有高度重复性；对不同的MSCs，富集的2-7位碱基具有重复。
(6)小鼠ENCODE转录组数据表明BMP9在肝脏中高表达，而BMP9相关的BMPI型受体ALK1在肺中高表达。
(7)BMP9在骨骼发育期仅以中等至低水平表达，在产后肝和肺组织中高表达。
(8)ALK1和ALK2在骨骼发育期表达含量逐步升高。ALK1在肺中高表达，而ALK2在脂肪和肾脏组织中表达相对较高。
(9)BMP9信号的负调控因子Smad6，Smad7和Noggin在小鼠出生后组织中广泛表达。
结论：
(1)使用BMP9诱导间充质干细胞分化，19ntRNA文库进行抗分化筛选，能获得具有一定抗分化特征的细胞群。
(2)富集的19ntRNA文库片段，具有规律性，具体发挥作用的机制可能和miRNASEEDs作用机制有关。
(3)BMP9及相关受体ALK1、ALK2在小鼠骨骼发育期表达逐渐增高，可能发挥重要作用。