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凝乳酶(chymosin, EC 3.4.23.4)是一种能够导致牛奶凝固的蛋白酶,在奶酪生产中具有巨大的商业价值。凝乳酶通常属于天冬氨酸蛋白酶家族或丝氨酸蛋白酶家族,广泛分布于各种生物和组织内。凝乳酶在牛奶凝固过程中起着至关重要的作用,它能够特异性地水解牛奶酪蛋白的Phe105-Met106键,导致整个牛奶酪蛋白稳定性下降,最终使牛奶凝固。除此之外,凝乳酶在奶酪成熟过程中也具有不可忽视的作用。因此,人们通过向不同来源的奶液(奶牛,牦牛,山羊以及骆驼)中添加凝乳酶,并采用不同的加工手段以获得口味各异的奶酪。青藏高原(Qinghai-Tibet Plateau)是世界海拔最高的高原,且气候环境恶劣,因此其拥有许多独特的生物质资源。牦牛,就是其中最典型的一种。牦牛为当地的居民提供丰富的食物(肉,乳,酥油等)。藏区牧民通常采用酸处理法和酶处理法(小牛皱胃凝乳酶)将牦牛乳(yak milk)加工成奶酪,这些奶酪就成为了当地居民的主要食物。牦牛乳与牛乳(cow milk)在组成成分、加工环境等方面的差异导致了牦牛乳奶酪加工工艺的独特性,第一,牦牛乳在总蛋白含量、脂肪含量、酪蛋白组成方面均与牛乳存在显著差异。牛乳中含有大量的α-casein和K-casein,牦牛乳中则含有大量的β-casein和κ-casein,这导致传统凝乳酶凝固牦牛乳的速度显著降低；第二,在牦牛乳奶酪生产过程中,乳液的pH环境通常为中性(6.5-8.5),传统的动物源和真菌源凝乳酶的凝乳活性在pH>5.5时会明显下降；第三,传统的凝乳酶通常只能在50℃以下的环境中保持稳定,牦牛乳奶酪生产过程中的高温环境会导致传统小牛皱胃凝乳酶凝乳活性的迅速丧失。因此,传统的小牛皱胃凝乳酶不再适合牦牛乳奶酪的生产过程。基于以上原因,我们开始了具有牦牛乳特异性凝乳酶的开发和研究工作。本论文的主要研究内容和研究结果如下：1.论文从藏区陈年奶酪中分离出一株名为QL-2的枯草芽孢杆菌,该菌株可以分泌大量的凝乳酶。为了进一步提高该菌株的产酶能力,论文以枯草芽孢杆菌QL-2作为出发菌株,经过物理诱变,获得凝乳酶高产菌株B. subtilis YB-3,该诱变菌株的凝乳酶产量是原始菌株QL-2凝乳酶产量的2.5倍。2.论文考察了营养因子及发酵参数对枯草芽孢杆菌YB-3生长及产酶的影响,并采用计算机模拟的方法拟合发酵生产凝乳酶的二元回归方程,构建发酵模型,获得最优的发酵参数,从而显著提高了B. subtilis YB-3的凝乳酶产量。此外,论文对凝乳酶YS-1的基因表达的实时定量研究发现,在B. subtilis YB-3发酵过程中,碱性发酵环境不仅会显著抑制菌体的生长,且会抑制MCE基因的高效表达。因此,培养基的pH环境对于B. subtilis YB-3合成凝乳酶具有重要的影响。在B. subtilis YB-3发酵产生凝乳酶的过程中,采用合理的pH控制策略,可以显著提高凝乳酶基因的表达量,进而增加B. subtilis YB-3的凝乳酶产量。根据上述结果,论文在10L发酵罐中,采用pH控制策略,将B. subtilis YB-3的凝乳酶产量由200 SU/ml提高到了1200 SU/ml,高于现有文献报道的B. subtilis的凝乳酶发酵产量。3.论文采用了两步纯化法对枯草芽孢杆菌YB-3发酵上清进行纯化处理,最终获得纯品凝乳酶YS-1。之后,论文从理化性质和分子生物学两个方面对凝乳酶YS-1进行了分类鉴定。鉴定结果显示,蛋白酶抑制剂(PMSF,β巯基乙醇,抑肽素等)对凝乳酶YS-1无明显的抑制作用,而EDTA会对凝乳酶YS-1产生强烈的抑制作用,因此可以初步推断凝乳酶YS-1属于金属蛋白酶家族。经肽指纹图谱测定,凝乳酶YS-1在gi56405351氨基酸序列上的覆盖率达到44.67%,进一步证明了凝乳酶YS-1属于金属蛋白酶家族。论文采用SDS-PAGE方法和Zymography方法确定了凝乳酶YS-1的分子量大小为42 kDa,且以单体形式存在。迄今为止,还没有文献报道过分子量大小为42 kDa的芽孢杆菌凝乳酶。这部分研究结果表明,凝乳酶YS-1的酶原剪切方式与现有枯草芽孢杆菌凝乳酶的酶原剪切方式存在明显的差异。论文又对凝乳酶YS-1的酶原基因进行克隆和测序,发现该凝乳酶编码基因与Bacillus subtilis金属蛋白酶基因(metalloprotease gene)同源性为98.64%,有16个碱基不同。将上述基因序列编译后,NCBI比对结果显示凝乳酶YS-1的酶原氨基酸序列与Bacillus subtilis metalloprotease氨基酸序列的同源性为98.24%,仅有九个氨基酸不同。但是,当以牦牛乳为底物时,凝乳酶YS-1的凝乳活性是枯草芽孢杆菌金属蛋白酶凝乳活性的115%(p<0.05),证实凝乳酶YS-1与枯草芽孢杆菌金属蛋白酶在凝乳活性方面存在差异。但是,凝乳酶YS一1序列差异性与其凝乳活性的关联有待进-步研究。4.凝乳酶YS-1在较大的pH范围(5.0-9.0)内会保持70%以上的凝乳活性,最适凝乳pH为7.0。凝乳酶YS-1在较大的温度范围(20℃-80℃)内也能够保持60%以上的凝乳活性,且在70℃具有最高凝乳活性。此外,凝乳酶YS-1对钠离子也具有一定的耐受能力。凝乳酶YS-1所具有的上述酶学性质,使其能够充分满足牦牛乳奶酪生产工艺的特殊要求。5.论文对凝乳酶YS-1的底物特异性及其作用机理进行了研究。论文首先分析了凝乳酶YS-1针对牦牛乳和牛乳的酶动力学,结果显示,凝乳酶YS-1对牦牛乳酪蛋白的亲和力显著高于对牛奶蛋白的亲和力,催化反应速度也较快,因此可以使牦牛乳快速凝固。为了进一步揭示凝乳酶YS-1底物特异性的作用机理,论文研究了凝乳酶YS-1对不同底物的蛋白水解行为,发现凝乳酶YS-1对不同酪蛋白底物的水解行为与真菌凝乳酶明显不同：当以1(酪蛋白作为底物时,真菌凝乳酶水解K酪蛋白仅会产生单一的水解产物(14 kDa)而凝乳酶YS-1水解K酪蛋白不仅会产生一个分子量大小同样为14 kDa的产物,还会产生一个新的水解产物(10 kDa)；当以β-casein作为底物时,真菌凝乳酶对β-casein几乎没有水解作用,而凝乳酶YS-1却能快速水解β-casein,并产生了三个新的水解产物(13kDa, 16kDa,20kDa)这就意味着凝乳酶YS-1对于β-casein具有较强的水解活性,且水解位点较少,因此我们有理由推测凝乳酶YS-1对于β-casein的高水解活性几乎不会导致奶酪的口味变差。论文还研究了凝乳酶YS-1对于不同底物的蛋白水解活性的差异,研究结果显示,与小牛皱胃凝乳酶和真菌凝乳酶相比,凝乳酶YS-1对β-casein和κ-casein的蛋白水解活性最强,因此能够使富含β-casein和κ-casein的牦牛乳快速凝固。6.最后,论文对凝乳酶YS-1制备牛奶奶酪和牦牛乳奶酪的可行性进行了评估。研究结果显示,凝乳酶YS-1所具有的较强蛋白水解活性并未对奶酪质地和口味造成影响,制备得到的牛乳乳酪和牦牛乳乳酪质地较硬,无苦味异味,明显优于商品化的真菌源凝乳酶。奶酪制备和评估试验均证明了凝乳酶YS-1不仅可用于牛乳乳酪的生产加工过程,还可用于牦牛乳乳酪和干酪素的加工过程,是小牛皱胃凝乳酶的理想替代品。