牙齿依靠牙根固定在牙槽骨中。牙根由牙本质牙髓复合体、牙骨质构成;牙本质牙髓复合体占据牙根的主体,而牙周膜通过牙骨质紧密地附着在牙本质表面。具有一定形态的组织工程化牙根结合传统桩冠将有可能成为新的治疗牙齿缺失的手段;同时,利用组织工程化牙根组织的方法也有助于改善传统种植体与牙槽骨的生物界面。牙本质牙髓复合体的解剖生理学特点决定了组织工程化牙本质的研究方法。成牙本质细胞是一种终末分化细胞,其前体细胞性质不明,如何有效地趋化和诱导其分化为功能性的成牙本质细胞?采取什么策略组织工程化具有一定形状和大小的牙本质?组织工程化牙髓中细胞外基质的改变对成牙本质细胞分化和牙本质形成有何影响?如果获得了牙本质牙髓复合体,如何在此基础上进一步组织工程化牙根组织?牙本质能否诱导牙骨质、牙周膜在其表面形成?针对这些问题我们进行了下列四方面研究:第一部分:利用不同支架材料离体诱导成牙本质细胞样细胞分化的研究本实验采用牙乳头离体培养方法比较了微孔滤膜(复合或者不复合TGF-β1))、PLA(复合或者不复合TGF-β1)诱导成牙本质细胞样细胞分化的能力。结果显示结合有TGF-β1的微孔滤膜能够有效地趋化成牙本质细胞前体细胞并诱导其分化,培养8 d后,与微孔滤膜接触的牙乳头细胞高柱状分化并有极性分泌现象;免疫组织化学和RT-PCR检测显示细胞表达DSP、OPN、Col I、DSPP、DMP1等成牙本质细胞特异性表型;透射电镜检测显示细胞极化、分泌功能活跃,与成牙本质细胞特点一致。而对照PLA组没有观察到极化的成牙本质细胞样细胞。研究结果说明,生长因子及其呈递模式在成牙本质细胞分化中起着重要的作用,设计诱导牙本质形成的支架材料时应该予以充分考虑。第二部分:组织工程化具有一定形状与大小的牙本质的可行性研究人工控制组织工程化牙本质的形状与大小具有重要意义。我们假设如果一种支架材料能够趋化并诱导组织工程化牙髓中的成牙本质细胞前体细胞在其表面分化成为功能性的成牙本质细胞,随后这些成牙本质细胞分泌和形成特异性的管状牙本质,而且这种细胞学反应和组织生成过程能够均匀地发生,那么所生成的牙本质的形态就能够大体上受支架材料的控制。为此我们将结合有TGF-β1的微孔滤膜植入牙乳头中培养,4 d后微孔滤膜能够诱导成牙本质细胞分化,透射电镜检测显示极化细胞具有分泌功能活跃的超微结构特点;7 d后极化细胞高柱状更加明显;20 d后有管状牙本质形成;30 d后牙本质厚度均一增加。免疫组化证明诱导形成的成牙本质细胞表达DSP、OPN、Col I等特异性标记;统计学显示4 d、7 d、20 d和30 d的细胞学反应和组织形成过程能够在比较大的范围内均一的发生。研究结果证明了先前提出的控制组织工程化牙本质形状与大小的策略具有一定的可行性。第三部分:组织工程化牙本质牙髓复合体的研究为了研究不同胞外基质环境对组织工程化牙髓组织的影响,我们原代培养了SD大鼠牙乳头细胞,然后分别利用离心的牙乳头细胞团、牙乳头细胞加胶原组织来工程化牙髓组织,并以牙乳头作为对照;将组织工程化的牙髓移植到大鼠肾脏被膜下30 d后进行HE检测。结果显示,移植30 d后,对照组中牙乳头外周形成规则的管状牙本质,内部为疏松结缔组织,没有散在的矿化组织形成;牙乳头细胞团组中,管状牙本质团块分散在牙髓组织中,数量较多,同时牙髓中还分布着骨样矿化基质;牙乳头细胞加胶原组中可见大量的骨样矿化基质与未吸收的胶原构成的矿化组织团块。研究结果表明胞外基质环境对牙髓种子细胞表型维持和分化具有重要影响,应该参照牙髓组织细胞外基质设计仿生支架材料。为了进一步研究结合有TGF-β1的微孔滤膜诱导组织工程化牙髓形成牙本质的能力,我们设计了牙乳头加复合有TGF-β1的微孔滤膜组,牙乳头细胞加复合TGF-β1的微孔滤膜组,牙乳头细胞加复合TGF-β1的微孔滤膜、胶原组,将种植体移植到SD大鼠肾脏被膜下7 d、30 d后取材。HE检测发现牙乳头加复合TGF-β1的微孔滤膜组移植7 d后有规则的成牙本质细胞沿着微孔滤膜分布,移植30 d后沿着微孔滤膜形成了管状牙本质,牙髓中很少见到散在矿化组织;牙乳头细胞加复合TGF-β1的微孔滤膜组移植7 d后有比较分散的成牙本质细胞沿着微孔滤膜分布,移植30 d后沿着微孔滤膜形成了管状牙本质,但是牙髓中可见散在大量矿化组织;牙乳头细胞加复合TGF-β1的微孔滤膜、胶原组移植7 d后有分散的高柱状细胞沿着微孔滤膜分布,移植30 d后没有管状牙本质沿着微孔滤膜沉积,牙髓中弥散着大量骨样矿化组织。研究结果表明复合TGF-β1的微孔滤膜能够诱导组织工程化牙髓分化成牙本质细胞和分泌管状牙本质,但是这种反应受到组织工程化牙髓中种子细胞与细胞外基质相互作用的影响。第四部分:组织工程化牙根样组织的研究为了验证组织工程化牙本质能否诱导牙骨质和牙周膜形成,并组织工程化牙根组织,我们首先原代培养了人牙周膜细胞,利用第二部分研究中的方法组织工程化牙本质,然后剥离微孔滤膜暴露牙本质,将人牙周膜细胞复合在牙本质表面后移植到裸鼠皮下20 d,取材观察。结果显示,牙周膜细胞能够在组织工程化牙本质表面形成致密的胶原纤维束并垂直牙本质表面排列,扫描电镜检测发现在胶原纤维束和牙本质之间有牙骨质样组织形成。新形成的牙周组织和牙本质共同构成了牙根组织。研究结果表明牙本质能够诱导牙周膜细胞在其表面形成包括类似牙周韧带和牙骨质的牙周组织,这可能与牙本质中存在的大量生长因子和其表面特性有关。综上所述,生长因子及其空间呈递模式在成牙本质细胞分化过程中有着重要作用,在设计诱导牙本质形成的支架材料时要予以考虑,结合有TGF-β1的微孔滤膜能够趋化和诱导成牙本质细胞前体细胞在其表面分化为成牙本质细胞。同时成牙本质细胞在微孔滤膜表面的分化过程和牙本质形成过程具有均一性,使得人工控制组织工程化牙本质的形状和大小具有了可行性。组织工程化牙髓中的支架材料对种子细胞的生物学特性以及成牙本质细胞前体细胞的迁移有重要影响,进而能够影响牙本质的形成过程。组织工程化牙本质能够诱导牙周膜细胞在其表面形成牙骨质和垂直排列的致密胶原纤维束,从而共同组成了组织工程化牙根组织。