牛支原体是一种危害养牛业发展的重要病原,在世界范围内广泛存在,可以感染任何年龄段的牛（包括野生状态下的北美野牛）。我国肉牛的牛支原体病多与运输应激相关,多数情况下表现为慢性肺炎和关节炎等。泌乳奶牛主要表现为牛支原体乳腺炎,犊牛经乳汁感染患牛支原体肺炎和关节炎。随着临床上抗生素耐药性增加,牛支原体病的防治已经是规模化养牛场面临的迫切问题,而这一问题的解决依赖于新药和新疫苗的开发。但是牛支原体致病机制不清楚严重阻碍新药和新疫苗的开发,进而阻碍牛支原体病的有效防控和治疗。支原体缺乏细胞壁,感染时膜蛋白可以直接与宿主细胞接触。因此,膜蛋白尤其是其中的脂蛋白被认为与黏附、侵袭、调控宿主免疫等密切相关。同时,支原体分泌蛋白也是一类可以直接与宿主细胞和免疫系统接触的蛋白质。但目前已有的研究主要集中在膜脂蛋白与宿主细胞互作上,支原体分泌蛋白的研究近乎空白。因此,本研究旨在探索牛支原体分泌脂蛋白在牛支原体感染宿主巨噬细胞中的作用及其机制。此外还证实了一种细胞膜蛋白NADH氧化酶同时具有酶活性和黏附素功能。本研究主要包括以下内容:1.牛支原体分泌脂蛋白的预测、验证及蛋白功能研究利用Signal IP 4.1和Secretome P 2.0在线分析软件预测牛支原体全部的脂蛋白,预测结果得到了39个分泌脂蛋白,并参考预测脂蛋白的保守功能域,选择12个脂蛋白进行验证和后续的功能分析。本研究利用原核表达系统得到了11个重组表达和纯化的脂蛋白。利用人工感染牛支原体的牛血清,证实11个预测分泌脂蛋白都具有空间抗原表位,而Mbov P468、Mbov P475、Mbov P537、Mbov P739蛋白同时具有线性抗原表位。利用上述11个预测重组分泌脂蛋白的小鼠多克隆抗体和提取的牛支原体分泌蛋白组,通过Western blot分析证实,Mbov P280和Mbov P475蛋白为牛支原体的分泌脂蛋白,而其余9个蛋白在牛支原体分泌蛋白组中未检测出。进一步研究了上述经验证的2个分泌脂蛋白（Mbov P280、Mbov P475）和3个免疫原性较强的脂蛋白（Mbov P468、Mbovp537、Mbov P739）与巨噬细胞的相互作用。首先利用去内毒素的重组脂蛋白刺激巨噬细胞,观测细胞的活力和炎性因子的分泌,结果显示:Mbov P280蛋白刺激牛巨噬细胞Bo Mac和小鼠巨噬细胞RAW264.7后,细胞活力明显降低（p＜0.05）;Mbov P468、Mbov P537、Mbov P739蛋白刺激Bo Mac细胞后细胞活力增强;Mbov P475蛋白刺激Bo Mac细胞后细胞活力没有变化。同时发现Mbov P739蛋白可以显著的刺激RAW264.7细胞产生IL-6、IL-1β、TNF-α（p＜0.05）。利用Western blot和信号通路抑制剂研究初步表明,Mbov P739蛋白刺激RAW264.7细胞后,P38蛋白的磷酸化和IκBα的磷酸化导致NF-κB和MAPK信号通路激活,进而造成上述炎性因子的分泌。其次,通过构建Mbov P280蛋白和Mbov P475蛋白的真核重组质粒并转染至Bo Mac细胞中表达,证明Mbov P280蛋白和Mbov P475蛋白在Bo Mac细胞中表达时,观察到Mbov P475蛋白聚集于细胞内,而Mbov P280蛋白呈弥散性分布。2.Mbov P280诱导巨噬细胞凋亡研究经Annexin-V/PI流式细胞仪检测发现Mbov P280蛋白可以显著诱导Bo Mac细胞凋亡,在Mbov P280蛋白浓度为1μM时可以诱导85.8%的细胞凋亡（p＜0.05）,而CCK8检测Mbov P280蛋白刺激细胞后细胞的活力也证实Mbov P280蛋白刺激细胞后细胞活力显著降低。通过分析Mbov P280蛋白氨基酸序列发现,其210位到269位氨基酸序列为不规则卷曲结构,通过对比缺失该区域的Mbov P280蛋白和完整Mbov P280蛋白刺激Bo Mac细胞后的细胞活力,发现缺失该区域的Mbov P280蛋白刺激细胞后细胞活力无变化,因此确定该蛋白的210位到269位氨基酸序列是引起Bo Mac细胞凋亡的主要功能区域。激光共聚焦显微镜观察证实Mbov P280蛋白与Bo Mac细胞的结合。进一步通过免疫沉淀方法筛选Mbov P280蛋白与宿主蛋白的互作蛋白,通过质谱测序发现其可能的结合蛋白是CRYAB（Crystallin,晶体蛋白）。据报道,CRYAB蛋白是一种抗凋亡蛋白,能与actin蛋白结合。由于本研究证实,Mbov P280蛋白可以诱导Bo Mac细胞凋亡,同时当Mbov P280蛋白结合到Bo Mac细胞上时与F-actin存在共定位现象,因此,得出结论:Mbov P280蛋白和宿主CRYAB蛋白结合可以诱导巨噬细胞凋亡。3.Mbov P475蛋白功能研究由于观测到Mbov P475蛋白在Bo Mac细胞中表达时主要集中于细胞核区域,所以进一步在牛支原体感染状态下检测了Mbov P475蛋白是否可以进入细胞核内。通过Western blot检测了牛支原体感染3h、6h、12h后的Bo Mac的胞质蛋白和核蛋白,发现从感染3h开始Mbov P475蛋白就可以进入到细胞核内,所提取的胞质蛋白和核蛋白分别使用α-tubulin蛋白和PRPA蛋白作为标签蛋白来检测是否存在交叉污染,支原体使用膜蛋白NOX作为标签蛋白,结果显示牛支原体未进入细胞核内,该研究进一步证实Mbov P475蛋白可以分泌到牛支原体外独立发挥作用。Chip-Seq被用来检测进入到细胞核内的Mbov P475蛋白结合的DNA序列,我们选取位于基因转录起始位点±2000bp内的启动子丰富的测序峰做进一步分析,结果显示159个峰注释后得到了117个可能的调控基因,其中71个基因编码蛋白质,占比为60.68%;假基因为30个,占比为25.64%;各种非编码RNA为16个,占比为13.68%。对117个基因进行KEGG富集分析发现,主要位于longevity regulating pathway和ribosome通路,同时也观察到CALM、NRAS、PIK3CA基因位于调控细胞周期、生长、分化、凋亡的Ras信号通路,提示Mbov P475蛋白可以结合到这些基因的启动子区域,进而调控基因的表达和细胞的生长状态。4.牛支原体膜蛋白NADH氧化酶（NOX）的功能研究通过分析牛支原体NOX蛋白的氨基酸序列发现其发挥酶活功能的功能域与B细胞表位不存在位置上的重叠,进一步对比其与肺炎链球菌黏附蛋白NOX的氨基酸序列,推测NOX蛋白具有黏附功能而且其黏附的功能域与酶活功能域不存在位置上的重叠。本研究通过间接免疫荧光、ELISA、流式细胞术等方法分别观测到NOX蛋白可以结合到宿主EBL细胞上,并且进一步检测NOX蛋白突变的牛支原体黏附EBL细胞的能力,其结果显示突变株黏附能力下降,以上结果都证实NOX蛋白是黏附素。制备抗NOX的多克隆抗体后,发现使用多克隆抗体可以抑制其黏附宿主细胞但是不能抑制其酶活功能,这一结果证明了其黏附的功能域与酶活功能域不存在位置上的重叠。通过噬菌体肺文库和免疫沉淀筛选牛支原体NOX蛋白和牛肺上皮（EBL）细胞系的结合蛋白,结果显示两种方法分别筛选出FN蛋白和CCDC132蛋白,通过ELISA方法验证了NOX蛋白和FN蛋白的结合;通过Co-IP的方法验证了NOX蛋白和CCDC132蛋白的结合。进一步通过荧光双染法检测到NOX蛋白突变株侵袭进入EBL细胞的能力下降（p＜0.05）,后续研究可以进一步探索NOX蛋白和FN蛋白互作并介导牛支原体侵袭进入宿主上皮细胞的机制。综上所述,本研究分析了11个预测分泌脂蛋白,验证出2个分泌脂蛋白Mbov P280和Mbov P475,初步确定Mbov P280可以引起牛巨噬细胞凋亡,其与宿主抗凋亡蛋白CRYAB结合可能是其诱导凋亡的重要机制;Mbov P475蛋白可以独立进入牛巨噬细胞核内与宿主基因结合。同时本研究分析和证实了牛支原体NOX蛋白同时具有酶活性和黏附素功能。