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新生隐球菌(Cryptococcus neoformans,C.neoformans)是一种带有荚膜的致病性真菌,该真菌感染常见于免疫功能缺陷或低下的人群,比如艾滋病病人,器官移植并接受免疫抑制治疗的病人等。在隐球菌感染中,由新生隐球菌引起的脑膜脑炎最为严重,经常会危及患者生命。新生隐球菌如何穿过血脑屏障(BBB)到达大脑实质是核心环节,对了解新生隐球菌的发病机制至关重要。因此,本研究试图探讨的科学问题是新生隐球菌如何突破血脑屏障,从血管中移行到血管外并进入脑实质?新生隐球菌跨越血脑屏障目前主要有三种假说,细胞旁路途径(Paracellularpathway,隐球菌通过紧密连接穿过内皮细胞层)、跨内皮细胞途径(Transcellularpathway,即通过胞吞作用,这一通路可能是由隐球菌表面透明质酸与宿主内皮细胞CD44分子相互作用而介导的)和“特洛伊木马”假说(Trojan horse pathway,即新生隐球菌潜伏在机体免疫细胞内,当免疫细胞跨越脑内皮细胞层后,由于免疫细胞很难将新生隐球菌杀死,新生隐球菌被重新释放出来,完成血脑屏障的跨越)。目前,动物体内还没有发现“特洛伊木马”存在的直接证据,同时,在新生隐球菌穿越血脑屏障的过程中,伴随着经典型(Ly6Chi)和非经典型(Ly6Clow)两个亚群单核细胞的招募,与Ly6Chi相比,对Ly6Clow单核细胞亚群在免疫过程中的招募机制及其在感染中发挥的作用研究较少。小鼠脑部感染新生隐球菌后,粘附分子和细胞因子在单核细胞招募过程中所发挥的作用,也是本研究要重点关注的问题。本研究基于小鼠体内新生隐球菌感染模型,采用活体荧光显微技术直接观察研究新生隐球菌侵袭脑组织的过程,并结合流式细胞术、qRT-PCR、免疫组化等方法,试图揭示吞噬新生隐球菌的单核细胞如何突破血脑屏障,从血管中移行到血管外并进入脑实质的机制。1、通过建立小鼠体内模型系统来研究新生隐球菌和BBB的作用,利用隐球菌脑膜脑炎H99致病菌株,证实了在侵袭脑部过程中“特洛伊木马”机制的存在。2、通过试验发现感染新生隐球菌后,小鼠脑组织中的单核细胞被招募到脑毛细管后微静脉中,在血管内皮细胞上进行滚动与粘附。3、单核细胞的招募主要依赖于VCAM-1/VLA-4介导的滚动和ICAM-1/CD11a介导的粘附,并且TNFR信号通路通过上调单核细胞上的VLA-4分子,在单核细胞招募过程中起到至关重要的作用。4、通过活体荧光显微技术观察,我们发现了小鼠脑组织中大部分吞噬新生隐球菌的单核细胞是Ly6Clow亚群,大量的Ly6Clow单核细胞内吞新生隐球菌后,携菌爬行并粘附在脑血管的内皮层,并逐渐迁移至脑实质。本研究为“特洛伊木马”假说提供了直接证据,证明了 Ly6Clow单核细胞是这一过程的重要参与者,该亚群单核细胞将有可能被用作预防新生隐球菌脑部感染的潜在靶点。