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目的我们用肠道粘膜佐剂霍乱毒素（Cholera toxin，CT）来诱导食物过敏（Food allergy），以研究肠道树突状细胞（dendritic cells，DC）和其亚群在CT打破耐受、诱导食物过敏中的作用和机理为核心科学问题，以现代细胞免疫学和分子免疫学方法为核心技术。联合应用转基因和基因敲除小鼠，研究在天然免疫水平上CT对肠道各DC亚群的影响，以及肠道DC亚群在CT的作用下对获得性免疫反应的调节性功能的变化，以期明确肠道DC和其亚群在CT诱导的食物过敏性反应中的作用以及可能的机制。为阐明食物过敏的机理做铺垫，为将来研制预防和治疗食物过敏的药物和方法提供理论基础。方法用IL-4-GFP×DO11.10杂交F1代小鼠，磁珠分选其CD4~+T细胞或流式细胞仪分选KJ126~+CD4~+T细胞尾静脉回输到Balb/c小鼠体内，给予Balb/c小鼠鸡卵清蛋白（Ovalbumin，OVA）或CT和OVA联合口服免疫，一周后取肠系膜引流淋巴结(Mesenteric lymph node，MLN)、派氏结（Peyer’s patch，PP）制备单细胞悬液，流式细胞仪检测MLN、 PP的CD4~+T细胞中IL-4表达水平，分析CT处理后能否诱导TH2反应。小鼠给予CT免疫，免疫后第一天、第三天、第六天分别取小鼠固有层(Lamina propria， LP)、 MLN、 PP制备单细胞悬液。对细胞悬液进行荧光抗体染色，流式细胞术分析不同时间点各DC亚群的变化并对各DC亚群中共刺激`分子的表达进行分析。分选FoxP3-GFP×DO11.10杂交F1代小鼠的CD4~+T细胞或KJ126~+FoxP3-CD4~+T细胞，尾静脉回输到Balb/c小鼠体内，给予Balb/c小鼠OVA或CT和OVA联合口服免疫，一周后取LP、MLN、PP制备单细胞悬液，流式细胞仪检测LP、MLN、PP的KJ126~+CD4~+FoxP3~+Treg表达水平，分析CT处理后能否促进肠道LP、MLN、PP的抗原特异性CD4~+T细胞增殖，能否将FoxP3-CD4~+T细胞转化为FoxP3~+CD4~+T细胞，从而证明CT处理后所产生的CD4~+FoxP3~+Treg是天然型CD4~+FoxP3~+Treg (natural Treg，发育自胸腺)还是诱导性CD4~+FoxP3~+Treg (induced Treg，由FoxP3-CD4T细胞分化而来)。我们还用FoxP3-GFP（C57BL/6背景）小鼠，分别给予小鼠OVA或CT和OVA联合口服免疫，一周后取肠道LP、MLN、PP制备单细胞悬液，流式细胞仪检测LP、MLN、PP的CD4~+FoxP3~+Treg表达水平，分析CT处理后能否促进肠道LP、MLN、PP的CD4~+T细胞增殖，诱导产生Treg。最后，我们用C57BL/6小鼠和MyD88-/-小鼠，分别给予小鼠OVA或CT和OVA联合口服免疫，一周后取LP、MLN、PP制备单细胞悬液，流式细胞仪检测LP、MLN、PP的CD4~+FoxP3~+Treg表达水平，在分子机理上分析髓样分化因子(Myeloid differentiation factor88，MyD88)在CT处理后所诱导的食物过敏反应中是否发挥作用。结果将IL-4-GFP×DO11.10杂交F1代小鼠的CD4~+T细胞或KJ126~+CD4~+T细胞尾静脉回输到Balb/c小鼠体内，给予Balb/c小鼠OVA或CT和OVA联合口服免疫，流式细胞仪检测发现，与只给予OVA免疫的小鼠相比，CT处理可以使MLN、PP的CD4~+T细胞中产生大量的IL-4。在CT处理后第一天，MLN的迁移性DC数量明显增高。同时我们还观察了各DC亚群在CT处理后不同时间点共刺激分子的表达情况。发现CT处理后第一天， LP的CD103~+CD11b~+DC、 CD103~+CD11b-DC以及巨噬细胞的CD86、PD-L1、PD-L2表达增高，在第六天基本恢复正常。MLN、PP的CD103~+CD11b~+DC、CD103~+CD11b-DC亚群CD86、PD-L1、PD-L2的表达在CT处理后第一天也显著增高。分选FoxP3-GFP×DO11.10杂交F1代小鼠的CD4~+T细胞或KJ126~+FoxP3-CD4~+T细胞尾静脉回输到Balb/c小鼠体内，给予Balb/c小鼠OVA或CT和OVA联合口服免疫，流式细胞仪检测LP、 MLN、 PP的KJ126~+CD4~+FoxP3~+Treg表达水平，结果显示回输CD4~+T细胞后CT和OVA联合口服免疫组比OVA组的抗原特异性T细胞显著增多，FoxP3~+Treg所占抗原特异性CD4~+T细胞的比例明显降低，回输KJ126~+FoxP3-CD4~+T细胞后抗原特异性的FoxP3-CD4~+T细胞可以转化为FoxP3~+CD4~+T细胞。用FoxP3-GFP（C57BL/6背景），分别给予小鼠OVA或CT和OVA联合口服免疫，流式细胞仪检测LP、MLN、PP的CD4~+FoxP3~+Treg表达水平，结果显示FoxP3-GFP（C57BL/6背景）小鼠经CT和OVA联合口服免疫组比OVA组的FoxP3~+Treg所占多克隆CD4~+T细胞的比例明显增高。用C57BL/6小鼠和MyD88-/-小鼠，分别给予小鼠OVA或CT和OVA联合口服免疫，流式细胞仪检测LP、MLN、PP的CD4~+FoxP3~+Treg表达水平，与C57BL/6小鼠组相比较，MyD88-/-小鼠经CT和OVA联合口服免疫组比OVA组的FoxP3~+Treg所占多克隆CD4~+T细胞的比例并没有明显增高。结论CT和OVA联合口服免疫可以在体内诱导OVA特异性CD4~+T细胞向TH2分化，诱导产生TH2反应。CT处理使MLN的迁移性DC数量明显增高。促进LP的CD103~+CD11b~+DC、 CD103~+CD11b-DC以及巨噬细胞的CD86、PDL-1、 PDL-2的表达，同时也促进MLN、 PP的CD103~+CD11b~+DC、CD103~+CD11b-DC亚群CD86、PD-L1、PD-L2的表达。回输抗原特异性CD4~+T细胞后CT和OVA联合口服免疫组与OVA组相比， CT处理后抗原特异性T细胞显著增多，说明CT处理可以使肠道LP、PP、MLN促进抗原特异性T细胞增殖，而FoxP3~+Treg所占抗原特异性CD4~+T细胞的比例明显降低，提示CT处理可以打破肠道的耐受状态，抑制抗原特异性Treg的生成。回输KJ126~+CD4~+FoxP3-Treg后抗原特异性的FoxP3-CD4~+T细胞可以转化为FoxP3~+CD4~+T细胞，这就说明CT处理所产生的Treg是FoxP3~+iTreg。FoxP3-GFP（C57BL/6背景）小鼠经CT和OVA联合口服免疫组比OVA组的FoxP3~+Treg所占多克隆CD4~+T细胞的比例明显增高，表明CT处理后能促进肠道LP、MLN、PP的多克隆CD4~+T细胞扩增，诱导产生Treg。与C57BL/6小鼠组相比较，MyD88-/-小鼠经CT和OVA联合口服免疫组比OVA组的FoxP3~+Treg所占多克隆CD4~+T细胞的比例并没有明显增高，说明CT诱导的多克隆CD4~+FoxP3~+Treg扩增依赖MyD88信号传导途径， MyD88信号分子在CT处理后所诱导的食物过敏反应中发挥着关键的作用。