莱氏野村菌(Nomuraea rileyi)是一种重要的虫生真菌,该真菌可以侵染多种鳞翅目害虫特别是对夜蛾科害虫具有较高毒力,具有良好的生防应用前景。莱氏野村菌需要使用麦芽糖作为碳源和持续光照才能够正常产孢。为了解决这一问题,本实验室通过使用AM培养基通过液体培养成功诱导出莱氏野村菌微菌核作为分生孢子的替代品应用于害虫生物防治。莱氏野村菌转录组数据和基因组数据的发布为莱氏野村菌基因功能研究提供了基础。但由于非同源末端连接效应的存在使得基因敲除效率极低。因此,目前迫切需要一种更为高效的基因敲除方法应用于莱氏野村菌基因功能的研究。论文以建立莱氏野村菌高效的基因敲除体系为基础,通过基因敲除的方法研究莱氏野村菌过氧化氢酶基因Nr Cat1和Nr Cat4的功能以及这两个基因在微菌核形成过程中所起的作用。还以基因敲除方法对过氧化物酶体膜蛋白Nr Pex16基因进行功能研究。研究结果对揭示氧代谢及其相关基因在微菌核形成发育过程中的作用机理具有重要意义,并能够为其液体发酵提供理论指导。研究取得的结果如下:(1)建立了农杆菌介导的Split-marker高效基因敲除体系1)Split-marker敲除载体的构建以线性敲除载体p PZP-hph-knockout为原始载体通过酶切连接手段构建了split-marker敲除载体p PZP-split-marker-A和p PZP-split-marker-B。并将gus基因做为反向筛选标记插入到p PZP-split-marker-B载体当中,构建成p PZP-split-markerB-gus载体。2)Split-marker基因敲除载体的遗传转化效率和基因敲除效率传统的Linear cassette方法的转化率为split-marker方法的11倍。分别使用linear cassette方法和split-marker方法敲除莱氏野村菌Nr Cat1,Nr Cat2和Nr Pex16基因,发现使用linear cassette方法三个基因的敲除效率分别为1.6%,4.2%和1.0%。使用split-marker方法结合反向筛选标记三个基因的敲除效率分别为81%,82.3%和64.1%。(2)莱氏野村菌过氧化氢酶基因Nr Cat1和Nr Cat4的研究1)Nr Cat1和Nr Cat4基因的克隆及序列分析克隆了莱氏野村菌过氧化氢酶基因Nr Cat1和Nr Cat4。生物信息学分析显示:Nr Cat1基因的ORF为2651bp,编码716个氨基酸。Nr Cat4基因的ORF为1130bp,编码385个氨基酸。蛋白质结构域分析发现Nr Cat1和Nr Cat4基因所编码的蛋白质均具有过氧化氢酶超家族特征,并且都具有一个亚铁血红素蛋白结构域。2)过氧化氢酶基因Nr Cat1和Nr Cat4在微菌核形成中的作用敲除Nr Cat1和Nr Cat4基因发现ΔNr Cat1突变体菌株不能有效的形成微菌核结构,培养液的色素浓度明显低于野生型菌株,微菌核的形成时间也延后;ΔNr Cat4突变体菌株可以形成微菌核结构,培养液的色素浓度略高于野生型菌株,微菌核的形成时间与野生型菌株相比略有提前。结合过氧化氢酶基因的时空表达模式分析发现,Nr Cat1和Nr Cat4基因均参与了微菌核形成过程中活性氧的调节和代谢。以上结果表明,Nr Cat1和Nr Cat4基因参与应对微菌核形成时所产生的氧胁迫,这两个基因的缺失均会对微菌核的形成造成影响。3)过氧化氢酶基因在莱氏野村菌生长,产孢,萌发以及抗逆中的作用测定了过氧化氢酶敲除突变体在常规培养基上的萌发、生长、产孢以及对不同胁迫条件下的表征。结果显示,ΔNr Cat1突变体菌株的菌丝生长速率为野生型菌株的1.1倍,产孢量为野生型菌株的82%,突变体菌株的孢子萌发时间比野生型菌株提前。这些结果表明Nr Cat1基因缺失影响了莱氏野村菌的生长,产孢和萌发。Nr Cat1基因缺失使菌株对过氧化氢的耐受能力下降,表明Nr Cat1基因在应对外源过氧化氢胁迫当中具有重要的作用。Nr Cat1和Nr Cat4基因的缺失还造成孢子耐热性的降低说明Nr Cat1和Nr Cat4基因也参与应对热胁迫。ΔNr Cat1和ΔNr Cat4菌株均对高渗透压胁迫不敏感,仅ΔNr Cat1菌株对刚果红敏感。4)过氧化氢酶基因缺失影响莱氏野村菌毒力体壁接种侵染斜纹夜蛾幼虫的菌株毒力测试表明,ΔNr Cat1和ΔNr Cat4突变体菌株相比野生型菌株对斜纹夜蛾的毒力降低,结合过氧化氢酶酶活性测定结果发现过氧化氢酶酶活性越低菌株的毒力越低。(3)莱氏野村菌过氧化物酶体膜蛋白基因Nr Pex16的研究1)Nr Pex16基因的克隆及序列分析克隆了莱氏野村菌过氧化物酶体膜蛋白Nr Pex16基因。Nr Pex16基因全长ORF为1157bp,编码385个氨基酸。蛋白质结构域分析发现,该基因编码的蛋白质具有Pex16超家族特征。2)Nr Pex16基因在营养生长,孢子萌发,产孢,两型转化以及抗逆中的作用Nr Pex16基因缺失严重影响了莱氏野村菌的营养生长和产孢。与野生型菌株相比,ΔNr Pex16突变体菌株在SMAY平板培养基上由酵母态向菌丝态转换的时间延长,Nr Pex16基因的缺失导致孢子萌发率下降。ΔNr Pex16菌株抗逆性实验表明,突变体菌株对氧胁迫,热胁迫和细胞壁破坏剂刚果红敏感,对高渗透压胁迫不敏感。3)Nr Pex16基因对莱氏野村菌脂肪酸代谢的影响ΔNr Pex16突变体菌株可以在以麦芽糖和醋酸钠为碳源的MM培养基上生长,而不能在以甘油酸三脂,橄榄油和Tween-80为碳源的MM培养基上生长。4)Nr Pex16基因缺失影响莱氏野村菌毒力体壁侵染生物毒力测试表明,ΔNr Pex16突变体菌株相比野生型菌株对斜纹夜的毒力显著降低,其原因可能是由于突变体菌株生长缓慢,代谢活性氧的能力下降,不能够利用昆虫体内脂肪酸作为碳源营养所致。结论:建立了基于农杆菌介导的莱氏野村菌split-marker遗传转化方法,该方法大大降低了无效转化,敲除率达到80%以上。莱氏野村菌Nr Cat1和Nr Cat4基因同为过氧化氢酶超家族基因,单独敲除一个基因会引起另外一个基因的代偿表达,这两个基因的缺失会影响莱氏野村菌的抗逆性,毒力,孢子萌发和微菌核的形成;Nr Cat1的缺失还会影响莱斯野村菌的菌丝生长以及产孢。Nr Pex16基因缺失会影响莱氏野村菌的菌丝生长,产孢,孢子萌发,抗逆性,毒力和脂肪酸代谢。