【摘 要】
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甾体化合物的生物催化羟基化在甾体药物生产具有极其重要的作用。P450酶的构象及其与氧化还原酶之间电子传递的适配作用影响着甾体羟基化的选择性而氧化还原酶的来源,种类,比例则直接影响电子传递效率,因此P450酶的构象构效关系与氧化还原酶的相互作用以及催化条件的优化对于提高甾体的羟基化效率至关重要。本文主要以细菌来源的CYP260A1为研究对象,通过定点突变对其进行改造,并为其适配不同电子传递链以提高其
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甾体化合物的生物催化羟基化在甾体药物生产具有极其重要的作用。P450酶的构象及其与氧化还原酶之间电子传递的适配作用影响着甾体羟基化的选择性而氧化还原酶的来源,种类,比例则直接影响电子传递效率,因此P450酶的构象构效关系与氧化还原酶的相互作用以及催化条件的优化对于提高甾体的羟基化效率至关重要。本文主要以细菌来源的CYP260A1为研究对象,通过定点突变对其进行改造,并为其适配不同电子传递链以提高其17α羟基化活性。利用定点突变筛选获得6个CYP260A1突变体,突变体S276I将17α-OH孕酮的产量提高到45%。研究不同电子传递体系对CYP260A1催化活性的影响,首先成功异源表达了细菌来源的黄素氧还蛋白（Fpr）,牛肾上腺细胞来源的铁氧还蛋白(Adx4-108),人来源的细胞色素还原酶（CPR）,体外转化时发现只有Fpr,Adx4-108能与CYP260A1适配生成17α-OH孕酮。构建重组的CYP260A1到毕赤酵母和酿酒酵母之中。酿酒酵母全细胞催化时未能观察到17α-OH孕酮。然而在毕赤酵母的全细胞催化中显示出17α-羟活性（4.1%）。为酿酒酵母构建了包括Fpr,Adx4-108,S276I的自组装体系但工程菌未能显示出17α-羟活性。进一步将其三组份构建到大肠杆菌系统之中,尽管S276I与氧化还原酶能够成功表达但并未发现17α-羟活性。对影响S276I体外催化效率的条件做了进一步研究,发现在反应体系中使用摩尔比S276I:Fpr:Adx4-108=1:4:50,加入2%2-羟丙基环糊精（2-HDC）溶解孕酮,p H 7.5时,在35℃下转化6 h后转化率达到最高（58%）。进一步评价组合突变体的羟基化效率,发现突变体S276I+L228A,S276I+V382A与野生型相比活性有了明显的提高,从17.6%分别提高到了39%和37%,但组合突变体所显示的17α羟活性并没有突变体S276I高。考虑到Adx4-108影响P450酶传递电子的效率,将Adx4-108的71位从苏氨酸突变成谷氨酸,与野生型（58%）相比,其转化率提高到了75%,这是由于磷酸化的Adx4-108提高了Adx4-108向CYP传递电子的效率。
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链霉菌作为重要的工业微生物类群,是抗生素、免疫抑制剂、抗肿瘤药物等重要化合物的生产菌。链霉菌中负责这些重要化合物合成的基因一般在基因组上成簇存在,长度从十几Kb到上百Kb不等。增加生物合成基因簇的拷贝数是构建工业高产菌株的主要策略之一,然而链霉菌现有的实现基因簇大片段多拷贝的方法具有周期长、效率低等多种局限性,限制了链霉菌工业高产菌株的开发。本研究基于位点特异性重组酶,开发了一种基因组连续整合的载
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由于其结构和功能的多样性,5-羟基亮氨酸作为手性前体、中间体和终产物参与了一些天然产物的生物合成,应用于合成各种化学材料和药物。目前,5-羟基亮氨酸主要的制备方法有化学合成、酶法生物合成,均存在局限。本研究针对这些问题,通过在谷氨酸棒状杆菌中引入5-羟基亮氨酸生物合成途径构建出一株遗传背景清晰、利于持续改良的工程菌株,并通过系统代谢改造提高了其产率。主要的研究结果如下:（1）为了在谷氨酸棒杆菌异源
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