论文部分内容阅读
目的：
1．构建含有完整乙型肝炎病毒X基因序列的基因疫苗并用该疫苗免疫BALB／c小鼠制备抗乙型肝炎病毒X蛋白的抗体。
2．鉴定抗乙型肝炎病毒X蛋白的抗体的特异性并初步判断其效价后，用该抗体检测肝细胞癌患者血清中X蛋白，同时对X蛋白阳性患者血清中X基因进行检测。
方法：
1．基因疫苗的构建：用PCR法从含有HBV X基因的原核表达载体pET-25b(+)-HBV X扩增含完整X基因的重组x基因片段，插入真核表达载体pcDNA3.1(+)，转化受体菌DH5α，酶切及测序证实。
2．基因免疫制备抗体：用质粒提取试剂盒大量制备基因疫苗。于BALB／c小鼠的大腿肌肉内注射100μg基因疫苗做初次免疫，并在第19，29，39及49天用相同剂量做加强免疫。证实免疫成功后在产生最大抗体滴度时摘眼球取血并分离保存血清。
3．抗体特异性鉴定及效价判断：每次免疫前一天和最后一次免疫后第2、4、6、8周经小鼠尾静脉取血分离血清。将原核表达载体抽提纯化后，转化表达菌株BL21(DE3)，用IPTG诱导表达重组x蛋白，用该蛋白鉴定血清中的抗体特异性并初步判断其效价。
4．肝细胞癌患者血清中X蛋白的检测：用基因免疫制备的抗体作为一抗、以western Blot法检测肝细胞癌患者血清中x蛋白。
5．HBx阳性患者血清中X基因的检测：用X蛋白(HBx)检测阳性患者血清中提取的DNA作为模板，以PCR法检测血清中x基因。
结果：
1．构建的基因疫苗．pcDNA3.1(+)-HBV X经用限制性核酸内切酶酶谱分析、DNA序列测定等方法证实含有完整的HBV X基因序列。
2．利用原核表达的重组X蛋白作为抗原，检测到经基因免疫后小鼠血清中的抗X蛋白抗体，该抗体特异性良好，其最大抗血清滴度为100左右。
3．利用该抗体检测肝细胞癌患者血清中的X蛋白，检出率为17.5％(7／40) 。
4．HBx检测阳性者血清中均能扩增出约470bp大小的X基因片段。
结论：
1．成功构建了含完整HBV X基因的基因疫苗pcDNA3.1(+)-HBV X。
2．用该疫苗进行基因免疫后的BALB／c小鼠血清中产生了抗X蛋白的抗体。
3．该抗体可用来检测肝细胞癌患者血清中的X蛋白，并与X基因的检测结果一致。