背景及目的:许多临床疾病可以导致膀胱过度活动症(Overactive Bladder, OAB),比如泌尿系统的感染、神经源性膀胱、间质性膀胱炎以及膀胱痛疼综合征等,除此之外,OAB也可以单独发生。OAB的病人以尿急为主要症状,常伴有尿频和夜尿增多,同时也会有尿失禁的发生,常常给病人带来生活上的痛苦和不便,长期的OAB还可引起输尿管积水和肾积水,严重损害肾功能。关于OAB的发病机理一直未能明确阐述,临床上OAB的治疗也一直着重于作用在神经受体M受体的药物,但治疗效果有限。所以关于OAB的研究一直受到众多的关注。在OAB的研究过程中,Joon Chul Kim发现在OAB的病人膀胱中前列腺素E2(Prostaglandin E2, PGE2)的分泌水平增高,提示PGE2是OAB疾病发生发展的一个重要因素。随后的研究也发现PGE2可以使膀胱逼尿肌的收缩频率和幅度增强,但PGE2作用于膀胱引起膀胱过度活动的具体机制未能明确,推测PGE2的受体在其中发挥了重要作用。研究发现PGE2的受体EP3可以影响膀胱的排尿间隔和排尿量,同时,在EP3受体基因敲除的小鼠中,也发现膀胱排尿量增加;向小鼠的膀胱内灌注PGE2可以引起膀胱的过度活动,但在EP3受体敲除小鼠的膀胱中灌注PGE2却并不能引起膀胱的过度活动。这些研究的发现提示EP3受体在膀胱过度活动中的重要作用,但EP3受体激活后对膀胱活动的机制研究同样也未有实质性的进展。膀胱的逼尿肌兴奋性异常是膀胱逼尿肌过度活动(Detrusor Overactivity,DO)的重要原因,膀胱过度活动症与逼尿肌过度活动有密切联系,所以研究膀胱逼尿肌兴奋性的机制将对膀胱过度活动症具有重要意义。许多年来,一直认为膀胱逼尿肌的兴奋性受到膀胱神经的支配,但随着研究的深入,尤其是有研究发现离体膀胱存在节律性的收缩,人们认为膀胱逼尿肌兴奋性的神经支配学说存在局限性,在膀胱中存在独立于神经支配的自发兴奋调控系统,并吸引越来越多的研究和关注。随后,Smet在人体和豚鼠膀胱中发现c-GMP免疫阳性的细胞在形态上类似于肠道的卡哈尔间质细胞(interstitial cells of Cajal,ICC),之后通过ICC细胞的特异性标记c-kit证实了膀胱ICC细胞的存在。在肠道中,ICC细胞具有起搏功能,能够将自身产生的细胞兴奋通过其与平滑肌细胞间的紧密连接传递到整个组织,是肠道慢波蠕动的发起者和控制者。ICC细胞的这些特点,吸引了人们的关注和研究。人们认为在膀胱中,ICC细胞同样具有起搏功能,能够产生细胞兴奋,同时,这也能很好的解释膀胱在去除神经因素的情况下仍能够产生自发收缩的现象。在膀胱活动不稳定的病人膀胱内,有研究发现ICC细胞的数量增多,也提示ICC细胞在膀胱兴奋中占据重要地位。对于ICC细胞的深入研究将对膀胱兴奋调控机制以及膀胱的过度活动具有重要意义。在对膀胱ICC细胞的研究过程中,发现了在膀胱ICC细胞中存在超极化电压门控通道(HCN通道),该通道有4种亚型,能够在细胞超极化的情况下被激活,在通道激活后,钠离子和钾离子能够通过该通道进入细胞内,从而形成一种内向电流,由于该通道的特殊的激活方式,其形成的这种内向电流被命名为“funny current”(If)。正是If的存在,使得细胞能够产生动作电位,自发产生兴奋。HCN通道首先在心肌细胞和神经细胞中被发现,同时其If也被证实在心肌细胞和神经细胞兴奋调控中的重要作用。目前的研究证实,HCN通道在膀胱中有且仅在膀胱ICC细胞上有表达,通过蛋白定量等实验也发现,HCN1通道的表达量最为显著,而HCN2、HCN3和HCN4通道的表达量相对较少。膀胱ICC细胞上HCN通道表达的发现,为膀胱ICC细胞可自发产生细胞兴奋提供了进一步的证据,同时也为研究ICC细胞兴奋的产生和调控提供了新的思路和方向。但关于膀胱中HCN通道的调控一直没有明确的研究与发现。综上所述,我们看到EP3受体的激活对膀胱功能具有显著的作用,而基于HCN通道作用的ICC细胞自发兴奋又在膀胱兴奋调控中起到重要的作用,我们拟研究EP3受体的激活能否通过作用于ICC细胞上的HCN通道,影响了ICC细胞的兴奋性调控,进而对膀胱的功能产生影响与作用。通过揭示EP3受体激活的作用机制,既进一步地阐明了膀胱兴奋调控机制,又为临床膀胱疾病治疗提供了新的靶点。方法:第一部分:EP3受体在膀胱ICC细胞上的表达在这一部分中,我们拟采用免疫荧光双染的实验技术,对EP3蛋白和ICC细胞特异性标记c-kit进行免疫标记,以确定EP3受体在ICC细胞上的表达;第二部分:EP3受体对HCN通道的影响作用(1)我们首先建立EP3受体特异性激动剂sulprostone的小鼠膀胱灌注模型,再利用Western blotting的实验方法比较正常小鼠膀胱中HCN表达情况和进行了sulprostone膀胱灌注的小鼠膀胱中HCN的表达情况;(2)我们将小鼠膀胱进行急性酶分离,将获得的膀胱ICC细胞利用膜片钳技术检测EP3受体的激动剂PGE2和sulprostone对HCN通道电流的影响;(3)我们利用单细胞PCR技术对我们在膜片钳实验中所用到的细胞进行c-kit的检测,以保证我们实验中记录的细胞确实为ICC细胞;(4)免疫共沉淀技术用来检测EP3受体蛋白和HCN通道蛋白是否存在直接的相互作用,以探究EP3受体激活作用于HCN通道的方式方法。第三部分:EP3受体激活对膀胱ICC细胞兴奋性的影响在此部分实验中,我们首先对小鼠的膀胱ICC细胞进行分离培养,利用钙负载技术,通过加入EP3受体的激动剂PGE2和sulprostone以及HCN通道的阻滞剂ZD7288检测EP3受体激活对膀胱ICC细胞兴奋性的影响,以及这种作用是否通过HCN通道实现。第四部分:EP3受体激活对膀胱肌肉收缩功能的影响在这一部分实验中,我们加入了 HCN1基因敲除小鼠,利用离体膀胱肌条实验探究EP3受体的激活对膀胱肌肉收缩功能的作用及影响,并探究这种作用是否通过ICC细胞上的HCN通达完成。结果:(1)免疫荧光双染实验显示,EP3受体在膀胱ICC细胞上有表达;(2) Western blotting实验显示,在用EP3受体特异性激动剂sulprostone进行膀胱灌注的小鼠膀胱中,HCN1和HCN4通道的表达量比正常小鼠膀胱组织中高,而HCN2和HCN3通道则没有差异性;(3)膜片钳实验显示,EP3受体的激动剂PGE2和sulprostone均可以使HCN通道的电流增强;(4)免疫共沉淀实验显示,EP3受体蛋白和HCN1及HCN4蛋白存在直接作用;(5)钙负载实验结果显示EP3受体激活后会使膀胱ICC细胞内的钙离子浓度增加,而EP3受体的这种作用可以被HCN通道的阻滞剂ZD7288所阻断;(6)在离体膀胱肌条实验中,EP3受体激动剂PGE2和sulprostone均能够使正常小鼠的膀胱肌肉收缩幅度增强,而且这种作用都可以被HCN通道阻滞剂所阻断;(7)通过离体膀胱肌条实验发现,预先在EP3受体阻滞剂L798106的作用下,PGE2对大鼠的膀胱肌肉收缩功能没有影响;(8)通过离体膀胱肌条实验,EP3受体激动剂PGE2和sulprostone均可以使HCN1基因敲除小鼠的膀胱肌肉收缩幅度增强,但是PGE2和sulprostone的作用效果均不如在正常小鼠膀胱中的作用效果。结论:(1)在膀胱ICC细胞上有EP3受体的表达;(2)EP3受体蛋白能够直接作用于HCN通道蛋白,从而增强HCN通道的表达和功能;(3) EP3受体能够通过影响HCN通道的功能从而增强ICC细胞的兴奋性;(4)EP3受体激活可以通过作用于ICC细胞上的HCN通道从而增强膀胱的兴奋性。综上所述,EP3受体激活后可以通过直接作用于ICC细胞上的HCN通道,使HCN通道的蛋白表达增多,HCN通道电流增强,从而增强了ICC细胞的兴奋性而引起膀胱的兴奋性增强。