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目的:在心肌肥大发生的过程中,不同因素刺激心肌细胞后产生的分子机制各不相同,一直是心肌疾病研究的重点之一。神经肽Y(NPY)是心血管系统中已知的分布最为广泛的神经肽类激素,与多种心肌病的发生发展过程密切相关。但NPY能否通过调控线粒体相关信号途径,直接参与心肌细胞肥大和损伤的调节目前鲜有报道。本研究以体外培养的原代心肌细胞作为实验材料,检测NPY对心肌细胞线粒体功能和细胞肥大的影响,并对其潜在的分子机制进行探讨,以期为心血管疾病的诊疗和心源性猝死的法医病理鉴定提供理论依据。方法:(1)采用联合酶(胰酶和胶原酶Ⅱ型)消化法分离出生72 h内的新生SD大鼠原代心肌细胞进行体外培养,记录细胞的搏动频率并鉴定心肌细胞纯度。(2)用不同浓度的NPY分别处理心肌细胞24 h和48 h后,检测心肌胚胎基因转录水平的变化和心肌细胞面积的改变。(3)不同浓度的NPY处理心肌细胞24h后,检测线粒体氧化应激、线粒体生物合成、膜电位及细胞活性的改变。(4)运用蛋白印迹的方法检测NPY处理原代心肌细胞24 h后,Ca2+和MAPK信号传导通路的激活情况。(5)应用ROS的清除剂N-乙酰半胱氨酸(NAC),探讨激活的信号通路与心肌细胞内ROS生成之间的关系。(6)应用Ca2+和MAPK信号通路的特异性抑制剂,探讨激活的信号转导通路在NPY诱导的线粒体功能改变和心肌细胞肥大中的作用。结果:(1)新生SD大鼠原代心肌细胞的培养和鉴定。新生SD大鼠原代心肌细胞在体外培养72 h后,心肌细胞的搏动比例和细胞搏动频率趋于稳定,免疫荧光染色结果显示90%以上的细胞表达心肌特异性标记物cTnT。因此,本实验中所采用的心肌细胞全部为原代心肌细胞,在体外培养72 h后,再用相关因子进行刺激和处理。(2)NPY诱导原代心肌细胞肥大。实时定量PCR结果显示,不同浓度(0、10、20、50、100 nM)的NPY分别处理原代心肌细胞24 h和48 h后,随着NPY浓度的上升,心肌胚胎基因ANP、BNP mRNA的表达水平明显上调,具有浓度依赖效应和时间依赖效应;对NPY处理48 h后的心肌细胞面积进行统计,结果进一步表明NPY可显著增加心肌细胞面积,诱导心肌细胞肥大,具有统计学意义。(3)NPY对线粒体氧化应激、线粒体生物合成和膜电位的影响。①NPY 增加心肌细胞内线粒体 ROS(mitochondrial reactive oxygen species,mt-ROS)和总 ROS(total reactive oxygen species,t-ROS)水平。应用线粒体超氧化物荧光探针对心肌细胞内mt-ROS生成进行特异性标记,结果显示NPY可显著增加mt-ROS染色的荧光强度,10 nMNPY即可引起mt-ROS增加2倍左右,100 nMNPY诱导mt-ROS生成的增加更加明显,具有浓度依赖效应;采用DCFH-DA荧光探针对心肌细胞内t-ROS进行标记,结果显示不同浓度的NPY处理原代心肌细胞24 h后,随着NPY浓度的增加,细胞内t-ROS的表达水平同样明显上升,具有显著性差异。②NPY增加PGC-1α、NRF-1、TFam的表达水平。蛋白印迹结果显示,与对照组相比,NPY明显上调线粒体生成的关键蛋白PGC-1α的表达水平,具有统计学意义。实时定量PCR结果显示,不同浓度的NPY可显著增加PGC-1α以及线粒体生成相关的转录因子NRF-1、TFammRNA的表达水平,具有显著性差异。③NPY降低线粒体膜电位和心肌细胞活力。JC-1荧光染色结果显示,不同浓度的NPY处理原代心肌细胞24 h后,心肌细胞线粒体膜电位逐渐降低,100 nM NPY可导致线粒体膜电位下降50%,具有统计学意义。CCK-8检测结果表明,随着NPY浓度的增加,心肌细胞活力明显降低,具有显著性差异。(4)NPY激活Ca2+和p38 MAPK信号转导通路。①NPY激活Ca2+/CaN和Ca2+/CaMK Ⅱ信号转导通路。与对照组相比,不同浓度的NPY处理原代心肌细胞24 h后,显著上调心肌细胞内CaN和p-CaMK Ⅱ的蛋白表达水平,对t-CaMK Ⅱ的蛋白表达量没有明显影响,提示NPY激活了心肌细胞内Ca2+/CaN和Ca2+/CaMK Ⅱ信号转导通路。②NPY激活p38 MAPK信号转导通路。与对照组相比,不同浓度的NPY处理原代心肌细胞24h后,显著上调细胞内p-p38的蛋白表达水平,不影响t-p38的蛋白表达量,p-p38/t-p38的比值显著增加,具有统计学意义,提示NPY可激活心肌细胞内p38 MAPK信号转导通路;与对照组相比,NPY处理不改变p-ERK、t-ERK、p-JNK和t-JNK的蛋白表达水平,提示NPY处理心肌细胞24 h后对ERK和JNK信号通路没有明显影响。(5)NPY激活的Ca2+和p38 MAPK信号通路依赖于心肌细胞内ROS的生成。蛋白印迹结果分析显示,与对照组相比,应用ROS的清除剂NAC可显著逆转100 nM NPY诱导的CaN、p-CaMK Ⅱ和p-p38 MAPK的蛋白表达水平上调,具有统计学意义。(6)Ca2+和p38 MAPK信号通路参与NPY诱导的线粒体损伤和心肌细胞肥大。①CsA、KN93、SB203580缓解NPY诱导的PGC-1α表达增加和线粒体损伤。蛋白印迹结果显示,与对照组相比,应用相关信号通路的特异性抑制剂CsA(Ca2+/CaN)、KN93(Ca2+/CaMK Ⅱ)、SB203580(p38 MAPK)处理原代心肌细胞后,可显著抑制NPY诱导的PGC-1α蛋白表达水平的增加,具有统计学意义。此外,CsA、KN93、SB203580处理原代心肌细胞后还可有效改善100 nM NPY诱导的线粒体膜电位降低和心肌细胞活力下降,具有显著性差异。②NAC、CsA、KN93、SB203580缓解NPY诱导的心肌细胞肥大。与对照组相比,应用NAC及CsA、KN93、SB203580处理原代心肌细胞后,可显著抑制100 nM NPY诱导的ANP、BNP mRNA的表达上调和心肌细胞面积增加,具有统计学意义。结论:(1)NPY可以直接诱导新生SD大鼠原代心肌细胞线粒体损伤和心肌细胞肥大。(2)NPY激活的Ca2+及p38 MAPK信号通路依赖于心肌细胞内ROS的生成。(3)线粒体氧化应激,以及进一步强制性激活线粒体生物合成,可能是NPY诱导心肌细胞肥大的机制之一。