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疫苗的免疫接种在禽流感(Avian influenza, AI)的控制中起看极为重要的作用。以鸡痘病毒(Fowlpox, FPV)载体表达禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)保护性抗原基因研制基因工程疫苗已发展到相当成熟的程度,但现有的重组鸡痘疫苗都存在着易受母源抗体干扰、免疫保护效果不如灭活疫苗的问题,以细胞因子作为免疫佐剂可能是增加疫苗保护力的有效途径之一。前期研究构建了共表达IL-6和H5亚型禽流感HA基因的重组鸡痘病毒。本文对这种重组鸡痘病毒生物特性,不同免疫途径抗体消长规律及免疫保护效力进行了系统的研究,为该疫苗的生产应用做了进一步的探索。1.重组鸡痘病毒rFPV-AIH5AIL6生物特性的研究重组鸡痘病毒rFPV-AIH5A、rFPV-AIH5AIL6、rFPV-IL6及野生型鸡痘病毒感染分别鸡胚成纤维细胞(CEF),于不同时间收获病毒测定生长曲线,结果显示,rFPV-AIH5A、rFPV-IL6、rFPV-AIH5AIL6与wt-FPVLP4种病毒的生长速度及蚀斑大小一致,无明显差异。将rFPV-AIH5AIL6连续传代至20代,取第0,5,10,20代重组病毒PCR扩增HA和IL-6基因,序列分析显示,与原代相比HA基因没有任何核苷酸发生变化,IL6基因在第20代时有1个氨基酸发生变化,但不影响蛋白的抗原表位；间接免疫荧光试验证明所选代次病毒均能表达HA蛋白,RT-PCR试验表明所选代次病毒均可表达鸡IL-6基因。将重组鸡痘病毒接种CEF,覆盖含X-GAL的琼脂后所有的蚀斑均为蓝斑。因此,重组鸡痘病毒具有良好的遗传稳定性。2.重组病毒不同免疫途径抗体消长规律的研究将10日龄SPF雏鸡随机分组,分别于颈部皮下,翅部皮下两种途径免疫rFPV-AIH5A, rFPV-AIH5AIL6, rFPV-AIH5AIL2, rFPV-IL6, wt-FPV, PBS。颈部皮下注射油乳剂灭活苗作为对照组。于免疫后10,14,21,28,35,42,49天采血,分离血清检测HI抗体效价。结果发现,两种免疫途径中,野生型鸡痘病毒疫苗株均可抑制鸡的增重,而重组鸡痘病毒对鸡增重无影响。翅部皮下注射能够产生较高的血凝抑制(HI)水平。rFPV-AIH5AIL6产生的抗体水平高于rFPV-AIH5AIL2, rFPV-AIH5A。重组鸡痘疫苗组在免疫后21天抗体水平达到高峰,28天后下降幅度不明显,49天时仍保持在一定的水平。3.重组病毒的免疫保护效力将10日龄SPF雏鸡随机分组,于翅部皮下免疫rFPV-AIH5A, rFPV-AIH5AIL6, rFPV-AIH5A+rFPV-IL6, rFPV-AIH5AIL2, rFPV-IL6, rFPV-IL2, wt-FPV, PBS,颈部皮下免疫油乳剂灭活苗对照组。于免疫后7,10,14,21d采血,分离血清检测HI抗体效价。结果发现,重组鸡痘病毒对鸡的增重无明显影响。rFPV-AIH5AIL6可诱导较好的HI抗体。免疫后21d,用H5亚型禽流感病毒攻毒后,rFPV-AIH5AIL6组和灭活疫苗组均达到了95%的保护,rFPV-AIH5AIL2组达到85%的保护,高于rFPV-AIH5A组及rFPV-IL6+rFPV-AIH5A高、低剂量联合免疫组。攻毒后3d,5d,7d采集喉头、泄殖腔棉拭子测定排毒,结果发现攻毒后第3天排毒率最高,其中rFPV-AIH5AIL6免疫组排毒率为最低。综上所述,本研究表明重组鸡痘病毒rFPV-AIH5AIL6具有良好的遗传稳定性和安全性,免疫效力试验显示rFPV-AIH5IL6在SPF鸡可诱导较高的H1抗体并产生较好的免疫保护作用,IL-6在rFPV-AIH5IL6免疫过程中起到了免疫佐剂的作用,这为研制新型的禽流感重组鸡痘病毒疫苗奠定了基础。