高产Mn-SOD菌株的筛选及酶的分离纯化

来源 :沈阳农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:solofly123
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从长白山温泉边的土壤中筛选出一株能高产SOD的菌株,通过抑制剂试验确定其所产SOD为Mn-SOD。该菌菌落为白色,不透明,表面光滑,边缘呈裂叶状,液体生长浑浊,静置成膜,菌体为直杆状,宽0.4nm-0.8nm,长2nm-3nm,孢子次端生,形状椭圆,该菌种生长温度范围为25℃-65℃,有运动性,革兰氏反应阴性,M.R反应阴性,V.R反应阳性,能利用甘露醇和葡萄糖产酸而不能利用木糖产酸,不能在10%NaCl上生长,能在7%NaCl和5%NaCl上生长,能够水解淀粉,该菌株初步鉴定为芽孢杆菌。 在形态学鉴定和生理生化实验的基础上,本实验进一步采用PCR技术对该菌株的16SrDNA进行扩增和测序,测序结果提交GeneBank(注册序列号为DQ318779)并进行Blast同源序列比对。以16SrDNA同源性为基础,取同源性较高的11株芽孢杆菌和该菌株用生物软件Clustalxl.81和Phylip做出进化树并进行系统发育分析,结果表明该菌株与Bacillussp的一系列菌株同源性高达99%且和Bacillussp.MO6在进化树上处于同一分支,据此可判断该菌株属于Bacillussp.,将其命名为Bacillussp.110-2。 对菌株Bacillussp.110-2进行碳源、氮源、碳氮比、培养时间、培养温度、起始PH值、接种量等发酵条件的优化实验。实验结果证明在以玉米粉4%为碳源,以蛋白胨1%为氮源,温度35℃,起始PH值8,添加无机盐CaCO3(0.02%),接种量8%,装液量70ml/250ml的条件下培养20h菌株产酶能力最强。 采用金属螯合层析和毛细管电泳两种方法对Bacillussp.110-2进行纯化,结果表明金属螯合层析不能将SOD的同工酶分开,毛细管电泳纯化的酶纯度更高,可直接进行质谱分析、原子吸收测定和氨基酸分析等。酶学性质研究表明,菌株Bacillussp.所产SOD由两个相同的亚基组成,每个亚基分子量为25KD;酶所含金属离子为锰;酶具有很强的耐碱性和较好的耐热性,在pH=13时酶活力仍达到114.4U/ml,在50℃下保温两小时酶活力基本不变;通过氨基酸分析发现菌株B.S110-2中的Mn-SOD含有较多的甘氨酸和丙氨酸,与其它来源的Mn-SOD相比,半胱氨酸和苯丙氨酸、酪氨酸这一类含有苯环的氨基酸含量大大增加。在蛋白质分子中能解离的氨基酸中,酸性氨基酸(Asp,Glu)与碱性氨基酸(Lys,Cys,Tyr和Arg)的比值为1:1.4;通过等电点电泳发现该酶的等电点为11.2。
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