伴边缘空泡肌病（myopathy with rimmed vacuoles）是指活检病理以边缘空泡为特征性改变的骨骼肌疾病。边缘空泡（rimmed vacuoles,RVs）是指新鲜肌肉组织冰冻切片经苏木精-伊红（hematoxylin-eosin,HE）或改良高默瑞（modified gomori trichrome,MGT）染色,肌纤维出现壁上粘附许多颗粒状物质的空泡,多见于萎缩、变性肌纤维中,多个或单个分布于肌膜下或肌纤维胞浆中,有裂隙状、不规则状、圆形等多种形态,RVs的颗粒呈嗜碱性,HE蓝染,MGT染色呈紫红色,空泡部位常伴有酸性磷酸酶活性升高。RVs并非肌纤维内真正的空泡,而是染色过程中的人工产物。RVs为次级溶酶体异常所致的骨骼肌疾病,出现RVs的肌纤维,高表达组织蛋白酶B,D,H,L和网格蛋白等多种同溶酶体相关的分子。RVs疾病中出现异常自噬溶酶体/自噬体与以下机制相关:（1）正常溶酶体无法降解过度的底物;（2）氧化应激反应;（3）内质网应激激活;（4）溶酶体酶功能缺失;（5）底物构象异常,无法正常降解;（6）自噬溶酶体降解能力下降;（7）不再进展的自噬过程。RVs并非特异性骨骼肌活检病理改变,其出现常可提示诊断/鉴别诊断,伴RVs肌病根据病因不同,分为遗传性/非遗传性,几乎涉及所有类型骨骼肌疾病。活检骨骼肌出现RVs,详细进行家族史、个人史的询问,结合患者临床查体及骨骼肌活检病理,排除药物所致、感染所致及散发性包涵体肌炎（sporadic inclusion body myopathy,sIBM）后,考虑伴RVs遗传性肌病诊断,涉及基因众多,包含多种遗传方式,目前文献报道的骨骼肌活检可见典型RVs的骨骼肌疾病,其相关基因包括:TIA1、TTN、LDB3、myotilin、MATR3、VCP、DES、FLNC、MYH7、GNE、PAPBN1、DNAJB6、TNPO3、HNRNPDL、TCAP、FHL1、MYH2。此外,轻型Becker肌营养不良（Becker muscular dystrophy,BMD）、面肩肱型肌营养不良（facioscapulohumeral muscular dystrophy,FSHD）及多系统蛋白相关包涵体肌病（inclusion body myopathy,IBM）,骨骼肌活检时均可见RVs。伴RVs骨骼肌疾病诊断面临以下问题:（1）是否为伴RVs遗传性肌病;（2）活检出现RVs的遗传性骨骼肌疾病涉及基因众多,如何进行基因检测,提高阳性率;（3）骨骼肌活检中,RVs出现在遗传性骨骼肌疾病中诊断/鉴别诊断的价值到底有多少;（4）为何多种遗传性骨骼肌疾病均会出现RVs,是否存在相同的机制导致了骨骼肌细胞的萎缩、凋亡,最终引起肌无力。随着测序技术发展,二代测序能够同时进行多种基因测序,对于诊断/鉴别诊断困难的骨骼肌疾病具有重要价值。相对于全外显子测序,靶向测序具有用时少、费用低及结果分析简单的优点,而被广泛应用于临床,大大推动了遗传性骨骼肌疾病的诊断率。本研究从自2005年至2018年河北医科大学第三医院神经肌病科标本库中选择骨骼肌活检病理出现RVs的病例,并排除炎性肌病、药物及病毒感染等继发因素后,诊断伴RVs遗传性肌病共35例,包括:（1）VCP一家系,共3例患者;（2）16例GNE肌病;（3）16例其他类型的伴RVs遗传性肌病。进行临床、病理分析,明确不同类型患者临床特点,明确RVs在骨骼肌疾病中的诊断价值及中国人伴RVs遗传性肌病疾病谱系。第一部分VCP肌病一家系研究目的:伴RVs遗传性肌病中,累及眼外肌及咽喉肌,出现眼睑下垂、眼外肌麻痹及吞咽困难的常见类型有:声带咽喉型远端肌病、眼咽型肌营养不良、眼咽型远端肌病及MYH2肌病。含缬络肽蛋白（Valosin-containing protein,VCP）基因变异所致的包涵体肌病（Inclusion body myopathy,IBM）,主要表现为肢带型肌无力综合征或远端型肌病,罕见累及面肌,而未见眼睑下垂、眼外肌麻痹及吞咽困难报道。方法:1.签署知情同意书后,通过门诊病历、住院病历、病史询问获得本家系所有成员资料,并进行家系血采集。2.获得辅助检查资料:肌酸激酶（creatine kinase,CK）、甲状腺功能三项、血清碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）,肌电图（electromyogram,EMG）,颅骨、脊柱正位拼接、股骨正位X线,双下肢骨骼肌MRI。3.活检骨骼肌病理分析及超微结构分析。4.先证者进行Sanger测序,排除眼咽型肌营养不良。5.进行遗传性骨骼肌疾病靶向测序,证实先证者携带已报VCP突变,相关家系成员Sanger测序对此位点进行验证。最后对先证者、先证者大姐及先证者父母行全外显子检测排除双基因致病可能。结果:1.先证者8岁饮水呛咳,14岁时眼睑下垂、走路慢,17岁吞咽费力,蹲下站起费力,走平路易摔倒,25岁听力、智能下降,仍可与人沟通交流,但言语明显减少,26岁卧床。21岁住院时查体:眼球各方向活动受限,听力正常,逆V形嘴,双侧软腭上抬可,余颅神经正常。四肢肌力:双上肢近端4级,远端4+级;双下肢近端3+级,双足背屈不能、背伸4级;双足下垂;肌张力低;全身肌容差;无深浅感觉异常,四肢腱反射消失,无病理征。CK:460U/L。左侧上下肢、胸锁乳突肌、眼轮匝肌EMG:肌源性受损。先证者胞妹自幼学习成绩差,考试曾得0分,7岁出现饮水呛咳,11岁眼睑下垂,足尖下垂,17岁时蹲下站起费力,言语明显减少,智能下降,吞咽费力,全身严重消瘦,20岁卧床,21岁去世。17岁时门诊查体:眼球各方向活动受限、听力正常,逆V形嘴,双侧软腭上抬可,余颅神经正常。全身严重肌萎缩,双足背屈不能,四肢肌力:双上肢4级,腰带肌2级,下肢近端3级,足背屈0级、背伸4级;四肢腱反射消失;病理征（-）。左上下肢、胸锁乳突肌、眼轮匝肌EMG:肌源性损害。先证者胞弟男性,18岁,饮水呛咳10年,眼睑下垂、言语不清伴远端型肌无力6年。无晨轻暮重、症状波动性。查体:双眼睑明显下垂,右睑裂4.0mm,左睑裂2.0mm;眼球各方向活动受限;鼻音;软腭上抬差;肌力:双上肢近端4级,双腕、手3级,双下肢近端2-3级,右侧较左侧稍差,双足踝、足趾背屈0-1级,双足踝、足趾背伸4级;四肢腱反射对称减弱,病理征（-）。MoCA评分24分,扣分项:命名-1,复述-2,抽象能力-1,记忆力-1,定向力-1。CK波动于958U/L-1340U/L,血清ALP 75U/L（45-125U/L）。颅骨、右股骨、腰椎正位拼接、骨盆X线:示右股骨、骨盆骨质疏松。颅脑MRI:小脑右侧沟回增多。右侧上下肢EMG,示胫骨前肌、腓肠肌可见插入、纤颤电位,胫骨前肌、腓骨长肌、踇短展肌、伸指总肌、肱桡肌及三角肌可见低窄MUP,感觉神经传导正常。先证者之母40岁以后出现全身广泛性疼痛,43岁出现痴呆,45岁行走费力,46岁卧床,47岁过世,过世前四肢肌无力明显,无眼睑下垂、眼外肌麻痹及饮水呛咳。先证者舅父45岁出现双下肢活动费力,蹲下站起困难,不伴眼睑下垂及痴呆表现。先证者外祖父母均于45岁之后出现痴呆表现,其外祖母伴有四肢活动无力,均于50岁左右过世。先证者二舅父（43岁）、大姐之女（4岁）,无相关临床表现。2.先证者及其胞弟双下肢骨骼肌MRI分析2例下肢肌肉MRI分析显示,肌肉组织出现片状脂肪浸润,不同肌群受累程度不同。大腿后群肌、小腿的前后肌群出现严重脂肪浸润。小腿脂肪浸润较大腿更为严重。大腿前群肌受累相对较轻。3.骨骼肌病理分析光镜表现:肌纤维直径大小不一,可见变性、脂肪变肌纤维,未见坏死、再生肌纤维。典型RVs存在于肌纤维的胞浆中。结缔组织中度增生。NADH、SDH、COX酶活性局限性减低或缺失。AMP酶活性正常。腺苷三磷酸环化酶反应,任意视野下可见两型肌纤维分布,I型肌纤维优势。酸性磷酸酶活性在部分肌纤维中增高。糖原及脂肪成分未见异常。先证者同其胞弟骨骼肌病理表现基本类似,但结缔组织增生更明显,RVs数目更多。电镜表现:内质网扩张,其上附着的核糖体脱落、模糊;线粒体脊模糊、扩张;异常次级溶酶体聚集;RVs为多层膜结构聚合形成;可见肌细胞核固缩。4.先证者PABPN1 1号外显子N端GCG数目为6次。5.先证者经过靶向测序确定携带VCP c.463C>A（p.R155S）杂合突变。经过一代测序,发现先证者大姐、二姐、之母、大舅父、外祖父均携带此突变位点。先证者、先证者之母、先证者之父及先证者胞弟进行全外显子检测,未发现除VCP c.463C>A（p.R155S）外有意义致病突变。结论:1.VCP肌病是VCP病最常见临床表现,以肢带型/远端型肌无力为主,罕见累及面肌的报道,而无累及眼外肌、咽喉肌报道,本研究扩展VCP肌病临床表现谱;2.VCP致病具有外显不全及高度临床异质性的特点,累及中枢神经系统、骨骼肌、骨骼出现多系统受累表现,同一家系成员可有完全不同的临床表型,严重病例可在青、中年死亡;3.骨骼肌MRI高度选择性肌群受累,对于诊断具有提示作用;4.骨骼肌活检RVs对本病缺乏特异性病理诊断价值,二代测序发现致病基因是诊断的重要依据。第二部分GNE肌病临床、病理及分子生物学研究目的:GNE肌病为最常见的远端起病伴RVs遗传性肌病,典型的临床表现以足下垂为首发症状,股四头肌相对不受累的特点,起病年龄主要为成年早期,部分患者怀孕可加重临床症状。临床表现可不典型,以近端肌无力起病,或手部无力起病,甚至有伴特发性血小板减少症病例报道。应用基因测序技术诊断了16例GNE肌病患者,并对其临床特点、骨骼肌MRI表现及病理特征进行总结,结合既往中国人群GNE肌病相关报道,明确中国人群GNE肌病临床、病理、基因突变特点。方法:1.入选标准:1)成年早期起病;2)首发症状:远端无力,病程较长者合并近端无力;3)散发、AR遗传;4)CK水平轻度升高;5)EMG主要表现为肌源性损害,部分患者合并神经源性损害;6)骨骼肌活检病理特点:RVs。为了进一步讨论骨骼肌受累的程度,13个患者进行双下肢MRI检查,3例患者仅进行双小腿MRI检查。2.收集患者临床资料,包括:家族史、临床表现、血常规、CK、EMG、双下肢骨骼肌MRI。3.活检骨骼肌病理分析。4.进行GNE测序,对致病位点进行总结。结果:1.本组研究包含16个患者,13个女性、3名男性。P2和P3同胞姐妹;P6父母近亲结婚,P8同胞姐姐有远端肌病临床表现,其余12例均为散发病例。患者起病年龄16-39岁,平均起病年龄为31岁。从起病至就诊年限从1年至20年不等。在16个患者中,12例患者表现为典型的GNE肌病,自双下肢远端无力起病,进展加重,渐累及双上肢及双下肢近端、颈肌及骨盆带肌。肌力评价:双侧胫骨前肌肌力0-3级,腓肠肌1-5级,股四头肌力4-5级。P5自双手远端无力起病,表现为双手握力下降,5年后出现双胫骨前肌无力,同时伴左下肢痛觉减退。P6患者左手无力起病,2年后累四肢肌肉及骨盆带肌。P13伴有血小板减少症。P16以双下肢近端无力起病,表现为蹲起、上下楼梯费力。肌力评价:双下肢近端肌力3-4级,足踝背屈、伸肌力5级,但双足踇指背伸0级,背屈4级。5个患者出现了颈肌无力。4例患者在怀孕期间病情进展迅速,孕前均无明显的肌无力表现,怀孕期间渐觉双下肢无力,产后均出现足下垂表现,并进展加重。CK水平正常至轻度升高,为62-1030U/L（正常值25-130U/L）,低于正常上限的10倍。P13患者血小板数目4×10⁹/L-26×10⁹/L（正常值100-300×10⁹/L）;骨髓中巨核细胞数目为48个/（1.5×3cm）,形态正常,PAIgG（+）。16个患者EMG均出现肌源性损害表现,其中4例伴有神经源性异常。应用MRI分析双下肢骨骼受累的情况。大腿肌群:长收肌、半腱肌最先受累,其次为半膜肌、股二头肌长头、股薄肌、及缝匠肌,晚期,仅股外侧肌保留。小腿肌群,比目鱼肌及胫骨前肌受累最重,其次为腓骨长肌、腓肠肌内侧头、趾长屈肌、胫骨后肌、而腓肠肌外侧头受累相对轻,至晚期小腿前后肌群可完全脂肪化。2.骨骼肌活检病理分析所有的患者均行骨骼肌活检。主要的病理像为RVs形成,不伴炎性细胞浸润。可见骨骼肌细胞大小不一,散在变现、坏死肌纤维。电镜可见髓样结构的RVs。3.分子生物学特点除P6、P14分别为c.830G>A（p.R277Q）和c.649T>C（p.Y217H）纯合突变;余14个患者为复合杂合突变。在16个患者中,一共发现14种不同的突变,其中7个为新发突变位点:c.541A>T（p.I181L）,c.125G>A（p.P42Q）,c.226G>A（p.V76I）,c.155A>G（p.D52G）,c.970C>G（p.H324D）,c.1055G>A（p.R352H）,c.859G>A（p.A287T）。在100例中国人中均未发现相同突变位点,应用SIFT及Polyphen2进行功能验证,所有的新发位点均为致病或可能致病。p.D207V在9个患者中检出,等位基因频率为28.1%,第二个常见的突变为p.R277Q,除了患者10和患者13突变位于GNE表位酶及激酶区域,其余14位患者突变位点均位于表位酶区域。结论:1.本研究16例GNE肌病临床表现与目前研究报道一致;颈肌受累、血小板减少、妊娠加重是值得关注的临床表现;有文献报道累及呼吸肌、心肌,本研究未发现上述临床表现;2.骨骼肌MRI选择性肌群受累,可作为与其他类型遗传性骨骼肌疾病鉴别诊断的重要特点;3.骨骼肌活检出现大量RVs时,结合临床远端肌无力为首发症状,高度可疑GNE肌病;RVs形成同细胞内异常蛋白沉积相关;4.一般情况下临床症状典型进行GNE一代测序,可减少测序成本,缩短测序时间;需要与其他类型伴RVs骨骼肌疾病鉴别时进行二代测序;5.本研究16例患者GNE新发突变7个,结合目前GNE已有160余种突变,说明GNE无热点突变,物种间具有高度保守性。第三部分其他类型伴边缘空泡遗传性肌病临床、病理及分子生物学究目的:目前普遍认为RVs形成与溶酶体功能异常或者是异常蛋白沉积影响肌细胞的自噬过程相关,RVs肌纤维免疫组化染色可以见到APP、Aβ-42、聚泛素、p62、TDP-43、tau蛋白等多种蛋白异常沉积。导致细胞溶酶体功能异常的多种因素,均可造成RVs形成,包括:氯喹/羟化氯喹药物中毒、HIV/HCV病毒感染、影响细胞唾液酸代谢及肌丝蛋白结构的基因突变等因素。RVs不具有病理诊断的特异性,在遗传性骨骼肌疾病,RVs出现的意义仍不能明确,因此我们对临床考虑伴RVs遗传性肌病的患者进行临床资料、病理收集,首先经GNE一代测序排除GNE肌病后,进行二代测序,以明确RVs在遗传性骨骼肌疾病中的诊断/鉴别诊断价值。方法:1.纳入标准:1)临床表现:进行性加重的四肢无力、肌萎缩,可表现近端/远端无力;2)CK升高,血沉、C反应蛋白正常;3)EMG:以肌源性损害为主,可伴有神经源性损害;4)双下肢骨骼肌MRI改变为选择性脂肪浸润,而非炎性改变;5)骨骼肌活检:可见数目不等的RVs,无炎性细胞浸润。2.收集患者临床资料,包括:家族史、临床表现、CK、EMG、双下肢骨骼肌MRI。3.活检骨骼肌病理分析。4.二代测序,对可疑DMD外显子缺失突变进行多重连接探针扩增技术检测,女性患者进行X染色体失活分析（X chromosome inactivation,XCI）。结果:1.临床资料分析本组研究包含16个患者,5个女性、11名男性。P14、P15为母子,其余患者均为散发病例,且均无阳性家族史。患者起病年龄14-54岁,平均起病年龄为34.43岁。从起病至就诊年限从1年至20年不等。在16个患者中,9例患者以四肢近端无力为首发表现,其中8例患者以下肢近端无力起病,1例患者以左上肢近端无力起病,其余7例患者均以下肢远端无力起病。2例患者肌无力为不对称性,P2右侧上下肢无力,P4仅有左上肢无力。P3患者合并吞咽困难。CK水平轻度至中度升高,除P4、P5患者分别为2775U/、2321U/L,其余患者为149-947U/L（正常值25-130U/L）,低于正常上限的10倍。16个患者EMG均出现肌源性损害表现,P3、P10伴有神经源性异常。我们对P6、P14、P15、P16共4例患者进行了骨骼肌MRI检查。P6的MRI显示股四头肌、胫骨前肌、大收肌、半膜肌及缝匠肌严重脂肪浸润,小腿后群肌受累轻。P14、P15均为小腿前群严重脂肪浸润,P14合并腓肠肌外侧头严重脂肪浸润,而P15腓肠肌外侧头相对保留,P14大腿MRI可见脂肪浸润,后群受累相对较重。P16骨骼肌MRI显示大腿后群严重脂肪化,仅股薄肌相对保留,而大腿前群肌及小腿肌肉轻度受累。2.骨骼肌活检病理分析所有的患者均行骨骼肌活检。可见数量不等的RVs,伴有肌纤维变性坏死及再生,结缔组织不同程度增生,6例患者出现不同程度的肌纤维脂肪变,可伴有中心核、核聚集及肌纤维分裂,NADH、SDH、COX酶活性不同程度缺失,肌原纤维网紊乱,2例患者出现擦图样改变,2例患者出现分叶肌纤维。酸性磷酸酶活性在变性、坏死肌纤维,及RVs周围均增高,糖、脂成分正常或继发性增高,4例患者Ⅰ型肌纤维优势,1例患者Ⅱ型肌纤维优势,其余患者两型肌纤维均正常分布。3.分子生物学特点经二代测序及MLPA分析,共5例患者有致病意义明确的突变位点。P4为DMD 3-12号外显子缺失,XCI失活比例>80:20而<90:10,符合中度倾斜模式。P13为DYSF c.3114₃115insCGGC（p.R1038fs）,c.5231G>A（p.G1744D）复合杂合突变;P14、P15为TTN c.95134T>C（p.Cys31712Arg）杂合突变。2例患者有致病意义不确切的突变位点。P3为FLNC c.4342T>G（p.C1448G）杂合突变;P10为TTN c.82815T>A（p.Y27605X）杂合突变。其余9例患者未见有意义致病突变。结论:1.伴RVs遗传性肌病不仅可表现为远端肌病,也可表现为肢带型肌无力综合征,除外GNE肌病后,伴RVs遗传性肌病患者临床近端、远端肌受累无明显差别;2.活检骨骼肌病理RVs散在分布见于各种遗传性骨骼肌疾病,如（肌营养不良等）,病理诊断需要结合其他病理现象,必要时单克隆抗体免疫组化染色在分子病理水平检测相关蛋白出现以资鉴别诊断;3.骨骼肌MRI为伴RVs遗传性肌病重要的临床内表型,对于诊断/鉴别诊断具有重要价值;4.伴RVs遗传性骨骼肌疾病的基因测序Panel需要进一步扩展,简化临床诊断与鉴别诊断。