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研究背景肿瘤是威胁人类健康最主要的疾病之一，肿瘤的治疗主要包括手术治疗、化学治疗、放射治疗和生物治疗。根据结构和作用机制，化疗药物可以分很多种，其中细胞毒药物可以引起DNA损伤，是化疗药重要的分支，主要通过攻击细胞DNA，形成双链损伤，最终引起细胞死亡，尽管细胞毒药物具有很强的细胞杀伤能力，细胞本身可以通过多种机制去修复这些损伤，当损伤被修复后药物对细胞的杀伤能力减弱，肿瘤细胞得以存活，影响化疗疗效甚至使化疗失败，提高这些化疗药的疗效是我们目前需要解决的问题。表观遗传学通过调节转录后与DNA相关的蛋白复合物而改变基因的表达，此过程不伴随着DNA序列的改变，转录后调节领域研究最多是乙酰化和去乙酰化，这2个过程主要通过2种具有相反作用的酶调节：组蛋白乙酰化酶和组蛋白去乙酰化酶，组蛋白去乙酰化酶参与DNA修复通路，可以调节基因的表达，表观遗传学改变对机体的生长和发育有着重要的作用，在肿瘤的发生、发展过程中也具有重要的影响作用。鉴于DNA损伤药物在肿瘤治疗过程中容易产生耐药和HDAC抑制在肿瘤的发生发展过程中的重要作用，本课题研究了HDAC抑制联合DNA损伤药物在肿瘤治疗过程中的作用，并对相关作用机制进行探讨。第一部分HDAC抑制联合DNA损伤药物对细胞的杀伤作用的影响和内在的作用机制目的：通过MTT检测新合成的NL101和苯达莫司汀对细胞增殖的影响，并对NL101具体作用机制进行研究。方法：分别用NL101和苯达莫司汀处理KM3和8226细胞系，利用MTT法检测对细胞增殖的影响和Western-blot检测凋亡相关的γH2AX。另外检测NL101处理细胞后组蛋白乙酰化相关蛋白的表达。结果：与苯达莫司汀相比，NL101能显著提高对细胞的杀伤能力，并通过检测发现NL101和HDAC抑制剂SAHA具有类似的作用，细胞经过NL101处理后，NL101可以显著增加乙酰化组蛋白H3的表达。结论：NL101具有和苯达莫司汀相似的细胞毒作用，同时还具有抑制HDAC的功能。第二部分HDAC抑制剂SAHA处理细胞后DNA损伤修复通路中基因mRNA水平的变化目的：通过real-time PCR检测HDAC抑制剂SAHA处理细胞后参与修复苯达莫司汀引起细胞损伤的通路中基因mRNA表达情况，进一步验证这些表达和以往研究报道是否一致。方法：用一定浓度的SAHA处理Hela细胞，DMSO溶剂作为空白对照，6-8小时后收细胞RNA反转录成cDNA，构建筛选基因real-time PCR引物，检测筛选基因mRNA表达水平的变化。结果：共统计了60个基因，SAHA处理后，细胞中CBP、TIP60、MORF、EP300、MSL1、TYMS的mRNA表达明显下降，表明HDAC抑制剂确实能下调某些基因的表达，同时也进一步验证了基因芯片的结果。结论：HDAC抑制剂处理细胞后确实能下调参与DNA修复通路中基因mRNA的表达，HDAC抑制剂可能通过下调DNA修复相关基因而影响药物的敏感性。第三部分SAHA下调的DNA损伤修复通路中的基因表达抑制对DNA损伤药物在鼠B淋巴细胞(Eμ-Myc p19Arf-/-)中作用的影响目的：利用逆转录病毒载体对筛选基因在鼠B淋巴瘤细胞(Eμ-Myc p19Arf/)中靶向抑制，观察这些基因表达敲低后细胞对DNA损伤的化疗药物苯达莫司汀和顺铂药物敏感性的影响。方法：构建筛选的6个基因(CBP、TIP60、MORF、EP300、MSL1、TYMS)带有GFP荧光标记的shRNA感染鼠B淋巴细胞(Eμ-Myc p19Arf/),建立筛选基因稳定敲低表达的鼠B淋巴细胞系，用DNA损伤药物苯达莫司汀和顺铂作用于稳转细胞系，根据GFP竞争测定方法利用流式细胞仪检测比较筛选基因敲低前后对药物的作用变化，GFP变化通过“抑制指数”进行计算，感染MLP空载体的细胞作为阴性对照。结果：用shRNA逆转录病毒载体感染鼠B淋巴细胞(Eμ-Myc p19Arf/)可以有效降低该细胞内筛选基因的表达，其中EP300、TYMS被敲低后细胞中GFP呈迅速下降的趋势，CBP、TIP60、MORF、MSL1敲低后细胞对在苯达莫司汀和顺铂的敏感性明显高于这些基因表达正常的细胞。结论：这些筛选的基因中EP300、TYMS被敲低后会影响细胞的存活，说明是细胞存活的必须基因，CBP、TIP60、MORF和MSL1被敲低后会明显增加细胞对DNA损伤药物苯达莫司汀和顺铂的敏感性。以上通过对一种新合成的药物NL101能明显增加抗肿瘤作用入手，利用基因功能研究方法，发现NL101不仅具有杀伤细胞的功能，还具有抑制HDAC的作用，通过对这种具有DNA损伤和HDAC抑制双重作用的药物进行研究，我们发现了HDAC抑制剂增加化疗敏感性的作用机制，对HDAC抑制剂在DNA修复中的作用有了更深入的认识，同时对HDAC抑制剂影响基因表达进行了探讨，组蛋白乙酰化被激活是某些参与DNA修复基因表达所必须的，这些发现为HDAC抑制剂在肿瘤化疗过程中使用提供了理论依据，克服了肿瘤细胞自身对药物引起DNA损伤的修复，明显增加了传统化疗细胞毒化疗药的作用，这种类似的DNA损伤和HDAC抑制联合药物为肿瘤治疗提供了新的研究方向。