川芎嗪对大鼠脊髓继发性损伤神经保护作用及机制的研究

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背景 脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)在大多数国家年发病率约为20~40/100万。但直到上世纪80年代,对SCI治疗仍然是前景悲观。之后随着基础、临床研究的深入发现绝大多数急性SCI并非离断伤,而表现为挫裂伤、出血、水肿、微循环障碍,损伤程度一方面与脊髓瞬间受力所致的初发损伤程度有关;另一方面SCI后几乎立即发生的继发于初期创伤的一系列神经生化、微循环失调形成的恶性病理连锁反应,对SCI发展可能扮演更重要角色。对于脊髓神经损伤,目前多数学者倾向于根据急性脊髓损伤所致的神经元死亡发生时间的不同分为二种形式:一种为原发性神经元死亡,是创伤暴力对神经元的机械损伤所致,在创伤暴力实施的瞬间发生,常常是不可逆的;另一种为迟发性神经元死亡,主要表现为兴奋性死亡和凋亡二种形式,在创伤后几小时、几天或更长时间发生,是由多种因素所致,一些常见的致病因素包括机械损伤、神经元缺氧、兴奋性氨基酸毒性作用、氧自由基损伤、神经元内Ca2+超载等。 细胞凋亡的相关基因可分为凋亡促进基因和凋亡抑制基因。即刻早期基因(Immediate early genes,IEGs)被认为是急性活动依赖性事件与基因长期表达之间联系的纽带。IEGs中c-fos、r-jun基因在多种细胞(包括神经细胞)中均有较低水平的表达,并参与细胞的生长、分化、信息传递等生理功能。研究认为c-fos是凋亡促进基因,其基因表达与神经元损伤后继发损害有关。Bcl-2可以抑制由多种细胞毒因素所引起的细胞死亡,bcl-2的过度表达能增强所观察细胞对大多数细胞毒因素的抵抗性。这一发现使人们认识到凋亡的各种信号转导途径有一个共同的通路交汇点,而该通路交汇点受bcl-2调节。而bax蛋白属于bcl-2家族,基本生物功能是促进细胞的凋亡。 在SCI病理机制中、迄今已知的所有病理现象和继发性损伤中所有的病理因素均可能与细胞内Ca2+超载有密切关系。细胞内Ca2+的超载已被认为是神经细‘第二军医丈李溥全笋夕讼戈胞死亡的最后共同途径。是SCI继发病理改变的始动因素之一。机制有:①伤髓微血管渗透性及细胞膜通透性增大、细胞器及膜结构广泛受损、导致细胞自溶;②Scl后,c扩+参与微血栓形成,导致局部微循环障碍;③C扩+作为第二信使物质,是细胞凋亡信息传递中的关键环节。刺激因素激活细胞受体G蛋白,磷酸肌醇系统,引起胞外钙内流、内质网/肌浆网钙库以及线粒体内贮钙释放。增多的c扩十继而激活多种蛋白酶如PHAZ,PKc,TIG,c扩十、Mg2+依赖性核酸内切酶等,最终导致凋亡发生。 目前已发现在脑、脊髓缺血性和机械性损伤模型中,广泛存在DNA损伤,表现为神经细胞凋亡、转录水平修复、相关基因表达等。而如何抑制促神经细胞凋亡的基因、生物因子,以及如何增加抗神经细胞凋亡的基因、生物因子,并及早识别细胞早期凋亡的特征,挽救濒临死亡的神经元己成为今后研究重点之一。 治疗SCI的策略目前有两种:一是在损伤急性期通过减轻或消除继发性病理反应、保护残存的轴突和神经元不再遭受二次损伤:二是在损伤慢性期促进神经组织的再生和修复。治疗SCI的方法目前虽然很多,但总的来讲大多不尽人意,还需深入研究。中药治疗SCI的实验研究虽取得了一定成绩,但如何从根本上解决SCI后功能恢复并将其推广到临床应用仍是一个鱼待解决的难题。 川芍为伞形科植物川芍的干燥根茎,而川芍啧是从川芍中提取的有效生物碱四甲基毗嗦(TetramethyPyrazine,TMP)具有活血化癖,抑制血小板聚集,钙通道阻滞,抑制血栓素凡的合成,影响一氧化氮基因表达,诱导增加HSP70表达等药理作用。最近研究发现,川芍嗦可明显上调脑缺血再灌注时bel一2的表达,抑制细胞凋亡;而bel一2可抑制神经元线粒体的渗透传导能力,抑制线粒体释放细胞色素c,而细胞色素C可促进凋亡的发生;川芍嚓能与C犷+通道受体可逆地结合,调节c扩十的细胞内流量,保持神经元线粒体的完整性。此外,川芍嚓可通过抑制c扩+超载、减少自由基的产生等与bel一2发生协同作用,也可通过抑制促凋亡基因如c一fos、p53、c-jun等发挥抗凋亡作用。在临床上,川芍嚓对急慢性缺血性神经系统疾病有肯定的疗效。但有关川芍嚓治疗SCI的研究报道甚少。目的: 我们在硕士课题“川芍嗓治疗大鼠SCI实验研究”的基础上,设计了以下实验,以进一步探讨川芍嚓治疗大鼠SCI的保护机理。一3一J袭二军医大学溥士学夕谐丈功戈荷妻方法: 1.利用改良的Allen’s打击法建立大鼠脊髓不完全损伤模型,并用川芍嗦对其进行干预治疗。 2.采用干湿法、原子吸收光谱法测量脊髓损伤段电解质、水含量的变化,以观察川苟嗦对其的影响。 3.采用Rl飞PCR和免疫组织化学染色(s ABC方法)分别检测SCI后基因c一fos、bcl一2、bax的mRNA水平和蛋白表达变化,以观察川芍嚓对其的影响。 4.HE染色观察伤后4周伤段脊髓白质残存面积,采用斜板试验和BBB评分观察大鼠后肢运动功能的恢复情况,以探讨川芍嗦神经功能恢复作用。结果: 1 .SCI后脊髓伤区内电解质和水含量的变化 SAL组伤后各时相点(lh、6h、12h、24h)脊髓伤区?
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