革兰氏阴性菌(Gram-negtivebacteria)感染时，细菌的细胞壁成份脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），或称为内毒素(endotoxin)被释放入血。释放入血的LPS广泛作用于机体多种组织器官，其中内皮细胞、巨噬细胞和中性粒细胞是最主要的效应细胞，在LPS的刺激下，它们产生大量的细胞因子，如肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素1(IL-1)、白介素6(IL-6)、一氧化氮(NO)、干扰素(INF)、血小板活化因子等，即“细胞因子风暴”(cytokinestorm)，进而引起失控性的炎症级联反应，最终引起内毒素休克、组织损伤和多器官功能障碍(mutipleorgandysfunction)。目前，对于内毒素血症的治疗主要有抗生素、抗内毒素抗体、炎性介质拮抗剂、传统中医药以及血液净化等方法。经典的抗感染和支持疗法如抗生素、抗内毒素抗体并不能有效清除机体内的内毒素，反而对机体有一定的负面影响;而从拮抗内毒素的触发、抑制内毒素的激活的细胞因子角度研发的炎性因子拮抗剂，在动物实验中疗效显著，但是在临床试验中却未取得良好的治疗效果;传统的中医药治疗对内毒素的清除具有一定的作用，但疗效不显著。因此，探索和认识内毒素血症的确切发病机制和干预措施，对防治内毒素休克及MODS具有重要的理论意义和实用价值。　　 TLR4作为LPS的识别受体，在LPS诱导的炎症反应中发挥了关键作用。TLR4被激活后，其介导的信号通路诱导了数百种基因表达的上调。在这些基因的表达产物中，不仅有促炎细胞因子和抗炎症调节因子，也有趋化因子、抗微生物的蛋白、组织修复因子、代谢调控因子和获得性免疫的控制因子。这些基因产物的功能不同，对组织损伤及内环境的影响也不同。例如，促炎细胞因子和抗微生物的蛋白对保护性免疫反应来说都非常关键，但是，持续或过度产生的促炎症细胞因子可以导致全身炎症反应及急性脓毒症休克;而过度产生抗微生物的蛋白对内环境稳定的作用非常小。所以，为了免受致病菌的感染，在炎症反应过程中需要对基因的表达进行精细的调控，既要控制促炎细胞因子的产生过度，以避免对组织的损伤;又要持续不断地产生抗微生物的蛋白，防止微生物的入侵。　　 然而，这些具有不同功能的基因都受到同一个受体(TLR4)及其介导信号通路的诱导，并且还发生在同一种细胞类型（如巨噬细胞）中，因此其调节必然处在启动子水平才有可能使得功能相同的基因可以按照它们的功能而选择性的被表达或沉默，而与受到相同的受体诱导的其它基因激活或抑制无关，即基因特异性的调节。　　 基因的特异性调控主要是通过核小体重构（核小体结构改变从而使DNA容易被接近）及组蛋白修饰实现的。最有说服力的证据来自对内毒素耐受(endotoxintolerance)机制的深入研究。内毒素耐受是指动物或体外培养的单核/巨噬细胞等在给予LPS预处理后，再次给予LPS刺激时对LPS的反应降低。在体动物模型中，表现为内生性致热原减少，动物死亡率降低等;离体单核/巨噬细胞则表现为LPS引起的炎性细胞因子如TNF-α、IL-6和IL-1的释放减少，但是与抗菌能力相关的分子如补体受体3(complementreceptortype3)和FcⅢ/Ⅱ受体表达上调，Cnlp(cathelicidin-relatedantimicrobialpeptide)表达增加。由于这两类基因的诱导表达都是通过TLR及其介导的信号通路，因此推测它们的表达是受基因特异(gene-specific)而不是信号通路特异（signal-specific）机制的调控;基因表达调控的关键可能在信号通路的下游染色质水平（包括核小体重构和组蛋白修饰）。为了弄清这两类功能不同基因表达调控的特异性机制，Foster等人按照功能和调节需要，将TLR诱导的基因分为两类。第一类基因，被称为耐受性(tolerizeable)基因，在耐受巨噬细胞受到LPS刺激时不能被再次诱导;第二类基因，非耐受性(non-tolerizeable)基因，在耐受的巨噬细胞中仍然可以被诱导。研究发现，耐受性基因包括了多种致炎症介质，而非耐受性包含了抗微生物的因子、病原体识别受体、趋化因子和非直接引起组织损伤的其它基因。进一步研究发现，这两类基因的诱导表达需要不同的染色质修饰模式。正常巨噬细胞受到LPS刺激时，上述两类基因启动子区的组蛋白4(H4)均发生了乙酰化，但是只有非耐受性的基因在受到LPS的再次刺激后其启动子部位的H4发生了再乙酰化。在内毒素耐受的巨噬细胞，不可耐受基因启动子部位组蛋白乙酰化水平的动态变化反映了基因表达水平的变化:即耐受的细胞在受到刺激前，与正常细胞相比其组蛋白乙酰化的水平保持在相对较高的水平;受到刺激后乙酰化水平进一步升高，甚至更快和更高。因此，可耐受基因和不可耐受基因其组蛋白的乙酰化状态直接与它们的转录活性相关。上述结果表明炎性细胞可以是通过组蛋白修饰调控特定基因的表达状态，如激活还是沉默。　　 对基因特异性调控的认识，使我们开始反思现有一些抗炎药物治疗效果不佳或者副作用过大的原因。由于过度或持续炎症反应对组织造成的损害主要由炎症介质的过度释放引起，而炎症介质的过度释放与相关信号通路激活有关,因此人们一直把注意力放在如何有效调控信号通路上，即试图通过抑制信号通路控制炎症介质的过度产生，其结果是同时抑制了抗微生物多肽或蛋白质的产生，使病人对感染的易感性增加，并且由于对其他保护反应如代谢和组织修复等的抑制而产生了很大的副作用。所以，探讨组蛋白修饰在基因特异性调控的作用，不仅有助于阐明内毒素休克及炎症相关性疾病的发病机制，而且为今后寻求更为有效、合理的抗炎药物具有积极的指导作用。　　 基于上述认识，本实验室前期利用蛋白质组学技术分析了小鼠内毒素休克后肝脏织核蛋白的变化，结果发现1.多个组蛋白成员的等电点发生了显著的酸化，这些变化多数发生在LPS刺激后的30min和3h时间点。组蛋白等电点的酸化主要与组蛋白的翻译后修饰有关，这些修饰主要包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化等，经过修饰的组蛋白可改变染色质的结构，进而对其下游基因的转录和表达发挥了至关重要的作用。2.找到了一些与组蛋白翻译后修饰有关的差异表达蛋白，如SETD4，其在核内出现的时间与组蛋白酸化的时间有着很好的一致性。现有的研究表明，含有SET结构域的蛋白家族具有组蛋白及非组蛋白甲基化转移酶的功能，参与了炎症及肿瘤发生发展的过程。SETD4是SET家族蛋白的一种，目前有关SETD4的报道很少，SETD4是否参与了脓毒血症发生发展过程，参与了组蛋白的甲基化作用，以及其在脓毒血症中发挥了怎样的作用目前尚不清楚。　　 因此，本实验的主要目的主要是检测SETD4蛋白在内毒素血症中的变化，验证前期的实验结果，并对SETD4在内毒素血症中的作用进行初步探讨。本实验分为两个部分:　　 第一部分:验证实验，LPS刺激后SETD4的变化情况。首先利用细胞免疫荧光以及核质分离技术检测了SETD4的定位及LPS刺激后移位情况;接下来利用Westernblotting和定量PCR检测了内毒素休克小鼠肝组织及LPS处理不同时间RAW264.7细胞中SETD4蛋白及mRNA水平的表达变化。SETD4是SET家族蛋白中的一个新蛋白，我们利用生物信息学分析了其理化性质，并预测了其结构;另外还检测了SETD4在不同种属，不同组织来源细胞中的表达情况。　　 第二部分:功能实验，探讨内毒素血症中SETD4对炎性细胞因子释放的影响。通过化学合成的特异性siRNA干扰细胞中SETD4表达，利用Luminex液相蛋白芯片技术定量检测LPS刺激后细胞培养上清中细胞因子的水平。探讨SETD4是否通过调节下游相关炎性因子的释放参与内毒素血症的发生和发展过程。　　 实验结果如下:　　 1、正常状态下，SETD4在胞浆及胞核中均有分布，但主要分布在胞浆中;LPS刺激0.5hSETD4开始入核，1、2h入核达到高峰，3h开始出核，6h基本恢复到正常。RAW264.7细胞的核质分离结果显示SETD4在胞浆与胞核中的变化趋势与免疫荧光的结果一致;　　 2、LPS(100ng/ml)刺激巨噬细胞，无论是巨噬细胞系RAW264.7还是原代巨噬细胞(BMM)，随着LPS刺激时间的延长，细胞中SETD4的蛋白表达水平逐渐升高。　　 3、用LPS（100ng/ml）刺激RAW264.7细胞，或给予小鼠(20mg/ml)LPS刺激，检测LPS刺激后细胞及小鼠肝组织中SETD4mRNA表达变化，并利用SPSS13.0进行统计学分析。结果显示，随着LPS刺激时间的延长，RAW264.7中SETD4mRNA水平升高，在0.5h达到峰值。经统计学分析，各刺激时间点之间无统计学差异;LPS刺激1h，小鼠肝组织mRNA有所升高，2h开始下降，3h持续下降，到6h降至最低水平，统计学分析各时间点变化均具有显著性差异。内毒素休克小鼠肝组织SETD4mRNA表达变化与蛋白表达变化趋势一致，提示内毒素血症中SETD4蛋白水平的变化主要受到转录水平的调控。　　 4、SETD4基因的生物信息学分析提示小鼠与人SETD4两个序列的一致性为77％(338/440)，保守性为87％(382/440)。SET结构域高度保守，主要由位于羧基末端的SET结构域和位于氨基端末端的底物结合结构域构成。一级结构分析显示，SET结构域由两端的SET-N，SET-C以及中间的SET-I组成，SET-N和SET-C高度保守，羧基端包含许多直接与活性相关的氨基酸残基，SET-I的插入数目可多可少，能特异性识别甲基转移酶的底物和辅助因子。二级结构是由少量的α螺旋，长度可变的β折叠结构以及不规则卷曲组成。SETD4蛋白在鼠源和人源细胞中均有表达，在总蛋白量相同的情况下鼠源细胞的表达水平较人源的高;SETD4的理论分子量约为49KD，但是鼠源细胞在40kD附近检测到两条带，而人源的只有分子量较大的一条带。提示尽管SETD4在不同种属、不同组织来源的细胞均有表达，但是其表达特征有一定区别。SDS-PAGE电泳时SETD4的实际分子量较理论分子量小可能与其迁移率发生了改变有关，或者是其剪切形式发生了改变等有关。　　 5、特异性siRNA下调巨噬细胞中SETD4的表达，当干扰效率达40％时，与对照组相比，LPS刺激12h炎性细胞因子RNATES、TNF-α、MCP-1、GM-CSF的释放减少;LPS刺激24h时，IL-α、IL-1β、RNATES、TNF-α、MCP-1、GM-CSF的释放进一步减少。即下调SETD4表达时，炎性因子的释放减少，提示SETD4对炎性因子的释放起正调控作用。　　 根据以上结果，可得到以下初步结论:　　 1.正常情况下，SETD4蛋白分布于胞浆及胞核中，主要位于胞浆;LPS刺激后SETD4出现入核-出核的变化，同时还伴随着蛋白表达的增加，提示SETD4可能参与了内毒素血症的发生与发展。　　 2.内毒素休克小鼠肝组织SETD4mRNA表达变化与蛋白表达变化趋势一致，提示内毒素血症中SETD4蛋白水平的变化主要受到转录水平的调控。　　 3.SETD4在鼠源及人源细胞中均表达，但表达水平及表达形式存在差异。　　 4.下调SETD4表达，LPS刺激巨噬细胞所致的炎性因子释放减少。提示SETD4通过调控炎性因子的释放参与了内毒素血症的发生与发展。