[RASSF1A基因在黑色素瘤细胞和组织中表达下调]RASSFIA是定位于肿瘤高频杂合性丢失区域3p21.3位点的抑瘤基因,编码一个微管相关蛋白。该基因在多种实体瘤组织中因启动子高甲基化而表达沉默,是迄今为止在肿瘤组织中甲基化程度最高的基因之一。前期多项研究指出,除了在上皮性肿瘤中发生甲基化之外,RASSF1A基因在恶性黑色素瘤细胞中也存在高频甲基化,提示该基因在黑色素瘤的发生过程中也可能存在表达异常。在本研究中,我们首次采用免疫组织化学及western blot的方法研究了RASSFIA基因在正常皮肤组织、皮肤色素痣以及恶性黑色素瘤组织和细胞系中的表达,结果发现,RASSF1A蛋白在正常皮肤色素细胞和色素痣细胞中高表达,而在恶性黑色素瘤组织中表达下调甚至缺失,并与肿瘤的转移呈负相关。RASSFIA蛋白在非转移性黑色素瘤细胞系中有微弱表达,而在转移性黑色素瘤细胞系中表达缺失。该结果证实了RASSFIA在黑色素瘤组织和细胞中表达下调,强烈提示RASSFIA参与了黑色素瘤的发生与演进过程。[RASSFIA基因具有抑制黑色素瘤细胞生长、增殖的作用]以往关于RASSFIA基因功能的研究绝大部分都是在上皮性肿瘤中开展的,为了进一步探讨RASSF1A基因是否参与了恶黑的发生发展,我们在RASSF1A基因表达缺失的恶黑细胞系中转染RASSF1A基因,恢复其表达,建立稳定转染的细胞系,研究该基因对恶黑细胞生物学行为的影响。细胞生长曲线测定结果表明,稳定转染RASSF1A基因抑制了A375细胞的生长与增殖能力；平板集落形成实验表明该基因同时抑制了A375细胞的克隆集落形成能力；进一步采用裸鼠移植瘤的方法证实,稳定表达RASSF1A基因不仅抑制了A375细胞的体外增殖能力,而且抑制了该细胞在裸鼠体内形成移植瘤的能力。以上结果表明：RASSF1A基因具有抑制恶黑细胞生长增殖的能力,是一个黑色素瘤抑瘤基因。[RASSF1A基因通过促进细胞凋亡,引起细胞周期G1-S期阻滞抑制黑色素瘤细胞的生长与增殖]肿瘤细胞的生长与增殖受抑制,通常是通过影响细胞周期进程或者凋亡过程而实现。为了研究RASSF1A抑制恶黑的机制,我们对细胞周期及细胞凋亡进行了分析。Hochest 33258染色发现稳定表达RASSF1A基因的A375细胞存在细胞核固缩、浓染,是典型的细胞凋亡的形态；通过流式细胞仪检测进一步证明,稳定表达RASSF1A的A375细胞凋亡率增加；细胞周期进程分析结果表明,稳定表达RASSF1A基因的A375细胞停留于G1期的细胞比例增加,而S期细胞比例降低,两者相比具有统计学差异,说明RASSF1A稳定表达引起A375细胞周期G1-S期阻滞。Western blot检测发现RASSF1A抑制了cyclin D1和磷酸化Rb蛋白的表达；RASSF1A抑制cyclin D1蛋白表达是通过降低其蛋白稳定性。以上结果说明,RASSF1A是通过同时影响细胞凋亡与细胞周期而抑制恶黑细胞的增殖能力与致瘤性。[RASSF1A基因对黑色素瘤细胞A375基因表达谱的影响]为了研究RASSF1A基因稳定表达对A375细胞基因表达谱的影响,采用Affimatrix公司全基因组表达谱芯片筛查受RASSF1A表达所调控的差异表达基因。筛选出受RASSF1A基因调控黑色素瘤A375细胞中差异表达的基因共210个,其中上调184个,下调26个基因。为了验证基因芯片的数据的可靠性,采用realtime RT-PCR方法检测部分差异表达的基因,结果表明realtime RT-PCR检测结果与芯片检测结果一致,说明芯片数据可靠。通过生物信息学分析差异表达基因的功能归类,发现RASSF1A调控的差异基因功能涉及转录与信号通路调控、细胞生长与增殖调控、细胞周期、细胞凋亡、细胞间粘附、细胞免疫应答等过程,提示RASSF1A可能通过影响这些基因的表达从而影响A375细胞相应的生物学过程。[RASSF1A基因通过上调ASK1表达活化P38 MAPK,激活线粒体凋亡途径]基因芯片筛查发现RASSF1A基因稳定表达引起细胞凋亡相关分子ASK1表达上调,结合前期发现RASSF1A稳定表达促进A375细胞凋亡,我们认为RASSF1A可能是通过影响ASK1的表达从而促进恶黑细胞凋亡。通过realtime RT-PCR和western blot检测证实RASSF1A转染后ASK1的表达水平上调。由于ASK1是JNK、P38 MAPK的上游激酶,我们采用western blot分析了JNK、P38 MAPK的表达,结果表明磷酸化P38 MAPK表达增加,total P38 MAPK表达水平没有改变；在RASSF1A转染细胞和空载体对照细胞中,我们没有检测到磷酸化的JNK表达。说明RASSF1A引起ASK1表达上调促进了P38 MAPK的活化；western blot分析发现RASSF1A下调Bcl2表达,并引起cytochromec从线粒体漏出至胞浆,促进了caspase 3的表达与活化,说明RASSF1A通过活化P38 MAPK激活线粒体凋亡途径,是其促进细胞凋亡的分子机制。在RASSF1A稳定表达的细胞中采用RNAi的方法抑制ASK1表达,结果细胞凋亡率下降,说明RASSF1A促进恶黑细胞凋亡的作用部分依赖于ASK1。[RASSF1A负调控AKT/mTOR信号通路]RASSF1A抑制恶黑细胞增殖、促进凋亡的作用有可能是通过影响细胞信号传导。采用western blot分析与增殖、凋亡密切相关的细胞信号通路的表达与活化,结果发现RASSF1A抑制了AKT的磷酸化,并引起其下游mTOR通路的p70S6K与eIF4E磷酸化水平降低,对其总蛋白表达没有影响,表明RASSF1A抑制了A375细胞AKT/mTOR通路的活化。在RASSF1A稳定表达的细胞中瞬时转染myc-AKT1质粒,结果发现过表达AKT1可以逆转RASSF1A对凋亡、细胞周期相关分子的调节,具体表现为：瞬时转染分子myc-AKT1引起RASSF1A/A375细胞中磷酸化P38 MAPK表达下调,而磷酸化eIF4E、Bcl2和cycling D1表达水平上调,说明过表达AKT1可以逆转RASSF1A对这些分子的调控作用,也就是说,RASSF1A抑制eIF4E磷酸化、Bcl2和cycling D1表达的作用是通过抑制AKT的活性而实现,因此RASSFIA抑制AKT/mTOR信号通路是其调控细胞凋亡、细胞周期进程的上游分子事件。