贫血是一种非常常见的疾病,影响着全球1/3的人口,其主要评价指标是血液中血红蛋白的含量。临床上治疗贫血的常用药物包括铁、维生素B12、叶酸、人重组促红细胞生成素(EPO)等。近年来,中医药治疗贫血吸引了越来越多学者的关注,在本研究中,我们对经典补血方剂当归补血汤进行了研究。当归补血汤最早见于《陈素庵妇科补解·调经门》(公元1127年～1131年),而其沿用至今的经典方则为金元时期李东垣的《内外伤辨惑论·暑伤胃气论》(公元1247年),该方重用黄芪以大补脾肺之气,通过补气来生血,因此,本研究主要是通过代谢组学、蛋白质组学、生物信息学等手段探索当归补血汤补气生血相关功效物质及内在机制。第一章文献研究本章节系统地综述了中医脾、气与能量代谢的关系,补气类中药及相关方剂对线粒体的影响以及当归补血汤遣方用药源流。第二章基于网络药理学及分子对接的当归补血汤补血作用机制研究及效应成分的预测第一节基于网络药理学的当归补血汤补血作用机制研究及效应成分的预测在本节中,首先从TCMSP数据库中获得了 125个当归中的化学成分和87个黄芪中的化学成分,经Lipinski五原则和ADME筛选后最终保留了 14个当归中的化学成分和23个黄芪中的化学成分,其中咖啡酸为两药共有成分。将这些成分导入到PharmMapper、Swiss、SEA和STITCH数据库进行靶点预测,共获得517个靶点,并进行功能分析和蛋白-蛋白相互作用分析,最终保留了 49个关键靶点,将这些靶点导入到DAVID网站进行GO功能富集分析和KEGG通路分析并结合Cytoscape进行成分-靶点-通路网络的可视化,结果共获得47条有显著性差异的KEGG通路,对47条通路进行进一步的功能注释分析,仅16条通路与当归补血汤的补血作用相关,如PI3K-AKT信号通路等;其中仅有32个靶点参与了这些通路,29个成分作用于这些靶点。GO分析结果表明当归补血汤能够促进能量代谢,并主要通过细胞质、质膜和细胞内蛋白结合,CXCR趋化因子受体结合和铁离子结合来调节炎症反应,肽基酪氨酸磷酸化和T细胞受体信号通路。基于整体动物对当归补血汤补血效应进行了验证,并采用ELISA测试盒对网络药理学中预测的关键靶点进行了测定,此外采用Western Blot对各组大鼠脾脏中PI3K-AKT信号通路上的PIK3R1、AKT、pAKT、mTOR和pmTOR蛋白表达进行了验证。结果表明当归补血汤对失血性血虚大鼠的外周血常规及胸腺及脾脏指数具有显著的改善作用,病理学结果显示当归补血汤能够增大失血性贫血大鼠脾脏脾小体体积,增厚胸腺皮质,还能增加胸腺和脾脏中的淋巴细胞数量。ELISA结果显示当归补血汤能够显著回调失血性贫血大鼠血浆中造血及免疫相关靶点(PTPN6,CXCL2,TGFBR1,IL-2,MET和ITK)的趋势,该结果表明当归补血汤的造血机制可能与其对红细胞增殖、分化和免疫增强的促进作用有关;Western Blot结果显示当归补血汤在整体动物水平上对于文献报道的在细胞水平上有激活作用的PI3K-AKT信号通路无影响。第二节基于分子对接技术的当归补血汤补血作用机制研究及效应成分的预测在网络药理学的研究中,主要是通过大数据的分析来预测某一化学成分、某一味中药或者某一首中药方剂的作用靶点,而其研究的主要前提和关键就在于化学成分的找寻。因此本节采用UPLC-TQ-MS/MS对网络药理学中经Lipinski五原则和ADME筛选后最终保留的14个当归中的化学成分和23个黄芪中的化学成分进行同时测定并采用MassLynx 4.1软件进行定量分析,由于洋川芎内酯K等为非市售品,最终,我们对28个单体成分进行了含量测定。结果共测得18个化学成分,其中白桦脂酸、β-谷甾醇、洋川芎内酯I、阿魏酸松柏酯、常春藤皂苷元、叶酸、华良姜素和黄芪皂苷I未被检测到,除非市售品外,网络药理学中预测到的主要活性成分均被检测到,该结果提示网络药理学的结果具有一定的可信度。将第二章第一节中与贫血密切相关的29个化学成分和32个靶点导入到SystemsDock(http://systemsdock.unit.oist.jp/iddp/home/index)进行分子对接,共获得对接得分大于等于6.11的14对,大于等于5.52的31对,大于等于4.82的35对,未计算出对接得分9对,黄芪甲苷、洋川芎内酯A、洋川芎内酯K与对应靶点都对接良好,其中黄苗甲苷最好。有效率结果提示当归补血汤中潜在活性成分可能为黄芪中的黄芪甲苷和当归中的洋川芎内酯A和洋川芎内酯K。结合含量测定、成分有效性及SystemDock分子对接得分,我们认为黄芪甲苷和洋川芎内酯A可能为潜在活性成分,因此,采用AutoDock软件进一步考察了黄芪甲苷与ZAP70和ITK,洋川芎内酯A与MET和MAPK14结合模式及亲和力。结果表明两个单体成分与相应蛋白具有紧密的结合能力,并主要以氢键和范德华力结合,其中洋川芎内酯A与MET结合更为紧密,黄芪甲苷与ZAP70结合更为紧密,提示洋川芎内酯A更偏重于补血和免疫增强,而黄芪甲苷更偏重于增强免疫功能,该结果为这两个单体成分的进一步药效学及分子机制研究提供了基础。第三章基于代谢组学及蛋白质组学的当归补血汤补血作用机制研究第一节当归补血汤对失血性贫血大鼠胸腺及脾脏组织代谢组学研究前期研究表明当归补血汤对失血性贫血大鼠具有很好的补血作用,此外对于病变的胸腺和脾脏具有显著的治疗作用。在本节中采用非靶向代谢组学策略探索了当归补血汤改善失血性贫血大鼠胸腺和脾脏病理状态的生物学机制。采用主成分分析法(PCA法)获得胸腺和脾脏在正负离子模式下代谢轮廓聚类趋势,结果可以看出正常组与模型组各自聚为一类,通过三组之间的PLS-DA图及相对距离计算结果可以看出,当归补血汤治疗后,其内源性变化减小,更趋向于正常组。结合Loading图中VIP值、数据库查阅及标准品比对等,在胸腺中共鉴定出10个内源性差异性标志物,主要为上调的溶血磷脂酰胆碱类成分(包括 LysoPC(16:0)、LysoPC(18:2(9Z,12Z))、LysoPC(18:1(9Z))、LysoPC(18:0)和 LysoPC(15:0))、花生四烯酸、吲哚酚硫酸盐、D-葡萄糖醛酸-6,3-内酯和胆酸,下调的吲哚丙烯酸;在脾脏组织中共鉴定出9个差异性标志物,主要为上调的LysoPE(16:0/0:0)、视黄酸酯和前列腺素E1,下调的吲哚丙烯酸、核苷(包括胸腺嘧啶核苷和黄嘌呤核苷)和氨基酸(包括D-亮氨酸、L-甲硫氨酸和L-酪氨酸)类成分。造模后胸腺中溶血磷脂类成分和花生四烯酸的上调提示胸腺的萎缩可能是胸腺细胞过度氧化应激而凋亡所致;脾脏中核苷和氨基酸类成分的下调则会导致线粒体质量、线粒体蛋白表达和线粒体呼吸的下降,进一步导致ATP供能下降。给予当归补血汤干预后,这些差异物均显著性回调表明当归补血汤可能具有抑制过度氧化应激和促进能量代谢的作用。第二节当归补血汤对失血性贫血大鼠胸腺及脾脏组织蛋白质组学研究本节中采用蛋白质组学方法(label-free法)对失血性贫血大鼠胸腺和脾脏中的差异性蛋白及当归补血汤的干预作用进行了探索,采用PEAKS 8.5软件对差异性蛋白进行鉴定,并结合生物信息学方法对其相关机制进行进一步阐明。结果在胸腺中共保留了 41个差异蛋白,大部分的蛋白质在贫血大鼠中下调,主要包括核糖体蛋白、髓过氧化物酶(Mpo)、铜蓝蛋白(Cp)、血红素结合蛋白(Hpx)等。其他一些蛋白质,如legumain(Lgmn)、烯酰辅酶A水合酶1(Ech1)、反应性中间亚胺脱氨酶同系物(Rida)等被上调,将这些蛋白导入到DAVID数据库进行GO分析,结果发现当归补血汤可通过氧结合、过氧化物酶活性和血红素结合等方式调节核糖体、细胞外空间等细胞器的氧传递、细胞铁离子稳态和对氧化应激的反应;脾脏组织保留了 24个差异蛋白,大部分的蛋白质在贫血大鼠中下调,主要为转铁蛋白(Tf)、NADH脱氢酶(ubiquinone)Fe-S蛋白(Ndufs3)、脂肪酸结合蛋白4(Fabp4)等,而补体C3(C3)、补体C3d受体2(Cr2)、肥大细胞蛋白酶10(Mcpt10)等8种蛋白表达上调,将这些蛋白进行GO分析,结果发现当归补血汤可促进脾脏线粒体复合物的生物合成,最终加速氧化磷酸化反应以提供ATP。该结果与代谢组学中的结论基本一致。第三节药效学、蛋白质组学与代谢组学关联分析及当归补血汤对能量代谢的影响差异性小分子和差异性蛋白的功能分析结果均提示胸腺的萎缩与胸腺细胞的过度氧化应激有关,脾脏功能下降主要与线粒体功能下降有关,为进一步探索其相关性,本研究采用皮尔逊关联分析法对药效学指标、差异性小分子代谢物和差异性蛋白进行关联分析,结果发现药效学关键指标强相关于大部分蛋白和内源性小分子,尤其是核苷类、氨基酸类成分以及Fabp4、Decr1和ndufs3蛋白。此外,吲哚丙烯酸在贫血大鼠的胸腺和脾脏中含量增加,并且与大多数蛋白质呈强相关,吲哚丙烯酸是色氨酸的代谢产物,具有抗炎作用,可能是失血性贫血的一种新的生物标志物。当归补血汤能上调胸腺中Mpo,Hbb,Cp含量,下调Ca2+水平,上调脾脏中Fabp4,Ndufs3,Tf,Decr1和ATP水平。通过文献查阅将小分子代谢物与差异蛋白进行关联研究,模拟出在胸腺和脾脏中发生的生物学过程,胸腺中的生物学过程为造模后,脂质代谢增强,分解出溶血磷脂类成分和花生四烯酸,溶血磷脂类成分可以促进NOS的形成、Ca2+水平上调以及线粒体中芬顿反应的发生,以上均会促进细胞氧化应激的产生而诱导细胞凋亡,此外造模后Mpo、Hgb、Hpx和Cp低表达进一步促进了氧化应激的发生;脾脏中的主要生物学过程为造模后,甲硫氨酸、亮氨酸、Fabp4和Decr1的下调抑制了 TCA循环,胸腺嘧啶核苷、黄嘌呤核苷和Ndufs3的下调抑制了线粒体复合物的合成,Tf的下调抑制了铁离子的转运,线粒体复合物和亚铁离子是线粒体氧化磷酸化供能的关键。该结果提示当归补血汤主要通过降低脂质代谢和细胞内Ca2+水平来抑制胸腺细胞凋亡,并通过促进脾脏ATP生成为贫血大鼠提供能量。第四章当归补血汤联合铁剂、rhEPO对癌性贫血小鼠补血作用及其作用机制研究第一节当归补血汤联合铁剂、rhEPO对癌性贫血小鼠补血作用研究癌性贫血(Cancer-related anemia,CRA)是由多种病因引起的,包括化疗引起的骨髓抑制、失血、肿瘤等因素,口服或静脉注射铁剂、皮下注射重组人促红细胞生成素(EPO)和静脉输血是治疗CRA的常用方法,近年来,中医药在CRA中得到了广泛的应用,因此,本节整合了结肠癌所致的缺铁性贫血及奥沙利铂抗肿瘤所致的再生障碍性贫血进行研究,采用当归补血汤联合铁剂及EPO对该复合型癌性贫血模型进行研究,评价指标主要包括体重、肿瘤体积、外周血常规、脏器指数、股骨病理学变化。结果发现模型组和给药组的体重均比正常组下降,剔除肿瘤重量后,ED组小鼠体重下降的最多;相比于肿瘤组小鼠,其他各组小鼠肿瘤体积均下降,而E组、ED组和DF组肿瘤体积最大,其次为P组和EDF组,最后为D-H组和D-L组;外周血常规结果发现仅ED组和EDF组对血常规各个指标均具有显著的改善作用;各给药组均能够显著降低脾脏指数,而对肝脏指数无显著性作用,仅EDF组和DF组对胸腺指数无显著性升高作用,D-H和D-L对肾脏指数无显著性降低作用;股骨病理学结果显示ED组和EDF组均能改善骨髓中造血组织减少、脂肪组织增多及间质中明显的充血和出血现象。以上结果提示,当归补血汤联合铁剂及EPO三药联用以及当归补血汤及EPO两药联用时补血效果最好,且两药联用效果更优于三药联用,但同时发现两药联用后肿瘤增长的更快,且肿瘤体积大于贫血模型组。第二节当归补血汤联合铁剂、rhEPO对癌性贫血小鼠肠道菌群的影响在典型的结肠癌小鼠模型中,定植于哺乳动物肠道的细菌在肿瘤发生和对治疗的反应中起着关键作用,铁对几乎所有细菌的复制和生存都至关重要,因此,本节采用Illumina-MiSeq测序法对C组、P组、ED组和EDF组小鼠的结肠内容物肠道菌群的变化进行了检测。α-多样性结果显示ED组丰富度、多样性和均一性均低于其他三组,而EDF组均高于其他三组;β-多样性结果显示各组样本均能很好的聚为一类,其中ED组和EDF组均接近于正常组,而EDF组与正常组更接近;菌群差异性结果显示与P组相比,ED和EDF组中Lachnospiraceae和条件致病菌Odoribacter的丰度均下降,这两个菌群的改变可能主要与癌性贫血有关。此外,EDF还可以降低肿瘤促进菌(Lactococcus,Helicobacter,Alloprevotella)、肠道失衡促进菌(Parabacteroides,Escherichia-Shigella)的,升高丁酸生成菌(Ruminococcaceae_UCG-014)的丰度,而ED表现出与EDF相反的作用,这可能是两药联用时肿瘤体积增长的主要原因。第三节当归补血汤联合铁剂、rhEPO对癌性贫血小鼠肠道内容物代谢组学研究本节中主要采用非靶向代谢组学的方法对癌性贫血小鼠肠道内容物中的内源性差异小分子进行鉴定,找出两药联用和三药联用补血及肿瘤体积差异的机制。PCA分析结果显示正负离子模式下,C组和P组能够很好的分离并各自聚为一类,通过四组之间的PLS-DA图及相对距离计算结果可以看出,EDF组更接近于C组,最终共鉴定出14个差异性标志物,造模后上调的为尿胆原、氨基乙氧基乙酸、植物鞘氨醇、鞘氨醇、磺酰胆碱甘氨酸、LysoPE(0:0/15:0)、石胆酸、1-硬脂酰甘油磷酸酯、牛磺去氧胆酸、花生四烯酸和胆固醇硫酸酯,下调的为L-酪氨酸、鞘氨醇1-磷酸和Nutriacholic acid。给药后,ED组中尿胆原、鞘氨醇类成分、石胆酸、牛磺脱氧胆酸、磺酰胆碱甘氨酸、鞘氨醇1-磷酸和Nutriacholic acid上调的更为明显,提示这几种小分子可能是ED组肿瘤组织增长的主要相关性内源性标志物;此外给药后ED和EDF组花生四烯酸和酪氨酸均下调,且两个给药组呈现相同趋势,提示这两个成分为与癌性贫血密切相关的内源性标志物。关联分析结果发现,鞘氨醇1-磷酸与Helicobacter呈现较强的正相关,通路分析显示主要涉及的通路为苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成、花生四烯酸代谢、酪氨酸代谢和鞘脂代谢,ED组肿瘤体积增大可能是由于鞘脂代谢失调后,肿瘤细胞的抗氧化应激能力增强所致。