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链霉菌属于革兰氏阳性细菌,是一种以产生抗生素著称的重要工业微生物。本研究室自行构建了以基因重组白细胞介素1可溶性受体为靶位的受体拮抗剂筛选模型,获得了一种由链霉菌139产生的新型胞外多糖依博素,该多糖由半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、岩藻糖、木糖、鼠李糖、半乳糖醛酸和葡萄糖以克分子数比19∶16∶5.0∶5.0∶4.0∶3.0∶3.0∶2.0组成,其重复单元的结构已经确定。经药效学研究表明该多糖具有明显的抗类风湿性关节炎的作用且毒性较低,已申报临床研究,有可能发展成为临床治疗类风湿性关节炎的新药。我室王玲燕博士首次从链霉菌139中确定了包含24个开放阅读框(openingreading frame,ORF)的依博素生物合成基因簇(GeneBank Accession Number∶AY131229)。序列分析推测各基因功能如下:转录调控基因(ste1-ste4)、糖基转移基因(ste5,ste7,ste15,ste22)、糖核苷酸前体的合成基因(ste6,ste10,ste11,ste17,ste19)、多糖的聚合与输出基因(ste8,ste9,ste13,ste14,ste21)以及多糖的修饰基因(ste12,ste16,ste18,ste20)。为了阐明依博素生物合成途径,研究依博素结构与生物活性关系并获得新型依博素衍生物,拟对不同开放阅读框(ORF)的功能进行深入研究。本文选择了ste10和ste7基因为研究对象。根据同源性分析发现ste10基因编码的蛋白与不同来源的天冬酰胺合成酶具有很高的同源性。已知天冬酰胺合成酶能够利用谷氨酰胺或氨作为氮源,催化天冬氨酸生成天冬酰胺。该酶广泛分布于原核及真核细胞,但在链霉菌中尚未见报道。为了确定ste10基因表达产物性质,本文将ste10基因克隆至大肠杆菌表达载体pET-30a,经37℃诱导和细胞裂解后,SDS-PAGE分析结果显示在70KD处出现了一条新的蛋白条带,与预计的分子量相符,Ste10蛋白在E.coli中以包涵体形式表达。重组蛋白经复性后,采用镍亲和柱层析进行纯化,HPLC分析纯度达到93%。酶学性质研究证明Ste10能够催化天冬氨酸生成天冬酰胺,该酶的Km值为0.9mM、最适温度为37℃、最适pH为8.0。为了进一步了解ste10在依博素生物合成中的作用,对ste10进行了同源重组双交换基因阻断实验。与依博素相比,基因缺失突变株Streptomyces sp.139(ste10~-)产生的多糖衍生物EPS-10m的单糖组成有一定变化;基因互补株Streptomyces sp.139(ste10c)产生的多糖衍生物EPS-10c,其单糖组成类似于EPS-10m。对IL-1R体外拮抗活性的ELISA分析结果显示,与依博素比较,突变株Streptomyces sp.139(ste10~-)产生的EPS-10m对IL-1R的拮抗活性降低,但这种拮抗活性降低可经基因互补回复。推测天冬酰胺可能存在于依博素的侧链结构,ste10可能作为一个调节基因参与依博素的生物合成。同源性比较结果显示ste7编码的蛋白与不同来源的糖基转移酶有很高的同源性。本研究通过基因同源重组双交换,经Southern杂交和PCR验证,获得了ste7基因缺失突变株。与依博素相比,基因缺失突变株Streptomyces sp.139(ste7~-)产生的多糖衍生物EPS-7m,单糖含量发生了较大的变化。六种单糖含量降低,其中葡萄糖(从3.9%→0.66%)与岩藻糖(从6.8%→1.41%)降低最为显著,约降低80%以上;另外两种单糖,半乳糖和鼠李糖含量增加。基因互补株Streptomyces sp.139(sre7)产生的多糖衍生物EPS-7c,与EPS-7m相比有较大变化,特别是岩藻糖有较明显恢复(从1.41%→2.10%),但葡萄糖基本无变化。与依博素相比,突变株Streptomyces sp.139(ste7~-)产生的EPS-7m对IL-1R的拮抗活性降低;但基因互补株产生的EPS-7c与EPS-7m相比,对IL-1R的拮抗活性显著恢复,在浓度为4.5μg/ml时甚至高于依博素,实验结果显示ste7可能编码岩藻糖糖基转移酶,参与依博素的生物合成。BLAST比较结果显示sre7和ste15编码的蛋白与糖基转移酶家族Ⅰ具有很高的同源性,都含有类似于pfam00534的结构域。以往研究显示ste15基因可能编码葡萄糖糖基转移酶,本研究通过基因同源重组双交换,在ste15基因缺失突变株Streptomyces sp.139(ste15~-)基础上,再进行ste7基因阻断,经Southern杂交和PCR验证,已经得到ste7和ste15双基因缺失突变株Streptomyces sp.139(ste7~- ste15~-),基因互补株筛选及变株单糖组分分析及生物活性测定正在进行中。综上所述,本研究通过对ste10、ste7基因单敲除及ste7-ste15基因双敲除等策略,有效的确定了各基因在依博素生物合成中的作用,为通过组合生物学途径研究多糖结构与生物活性关系,获得具有生物活性的新结构多糖奠定了较好基础。有关链霉菌中天冬酰氨合成酶的性质与功能研究国内外未见报道。