论文部分内容阅读
脑卒中是临床上的一种常见病和多发病,包括出血性脑卒中和缺血性脑卒中两种亚型。在我国,出血性脑卒中约占所有脑卒中的30%。脑出血(intracerebral hemorrhge, ICH)可引起脑组织的严重损伤,其致死率及致残率均较高,给社会和家庭带来沉重的负担。因此,脑出血的研究一直是神经科学领域关注的重点和热点。 ICH不仅可以引起神经元的损伤,也可以引起大脑白质的损伤。白质主要由神经纤维构成,神经纤维包括了有髓纤维和无髓纤维,有髓纤维包含了中央的轴突及缠绕包裹在其表面的髓鞘。研究表明,轴突和髓鞘对缺氧、兴奋性毒性及物理性损伤都非常敏感,而轴突和髓鞘的损伤均可导致正常的神经信息传递出现障碍,继而引发一系列的神经功能障碍。在临床上,内囊及基底节区的出血极其常见,由于内囊区有大量重要的感觉和运动传导束通过,因此,出血后引起的轴突和髓鞘的病变均可导致严重的神经功能障碍,如偏身性感觉障碍,偏瘫,双眼对侧视野同向性偏盲等,临床上称之为“三偏”症。由于内囊区是脑出血的高发区域,且出血后会导致严重的神经功能障碍,因此对脑出血所致的内囊神经纤维脱髓鞘病变及其机制进行深入研究,具有重要的理论意义和临床价值。 目前对于脑出血的研究主要集中在神经元的损伤,罕有研究涉及轴突及髓鞘的损伤,少突胶质细胞细胞作为中枢神经系统髓鞘的形成细胞,出血导致的少突胶质细胞的损伤必然将引起髓鞘的病变,而现今对少突胶质细胞的凋亡与脑出血后神经纤维的脱髓鞘病变间的关系尚未见报道,为此,本实验拟在制作ICH动物模型的基础上,采用透射电镜、免疫印迹、免疫荧光双标等实验技术,明确脑出血是否能导致内囊神经纤维出现脱髓鞘病变,研究神经元/少突胶质细胞凋亡与脑出血后神经纤维脱髓鞘病变之间的关系,并探寻介导少突胶质细胞凋亡的可能信号通路,以丰富对脑出血病理机制的认识,并为脑出血的治疗提供新的思路和理论基础。 目的: 明确脑出血是否能导致内囊神经纤维出现脱髓鞘病变,研究神经元/少突胶质细胞细胞凋亡与脑出血后神经纤维脱髓鞘病变间的关系,探寻介导少突胶质细胞凋亡的可能信号途径。 方法: 成年健康雄性 Sprague-Dawley大鼠,随机分成 sham组(n=28)和模型组(n=84)。采用自体血注入法制作脑出血实验动物模型,sham组仅插入微量注射器,不注血,模型组又分成出血后1、3、7d三个实验组进行观察。运用 mNSS评分体系对大鼠的神经功能进行评估,通过透射电镜检测sham组及ICH后内囊神经纤维髓鞘的病理变化,并同时使用免疫印迹检测ICH后内囊区髓碱性蛋白(myelin basic protein, MBP)、Active Caspase-3、Caspase-12以及Cytochrome C的表达变化。采用免疫荧光双标技术检测ICH后内囊区少突胶质细胞标记物CNPase与Active Caspase-3、神经元标记物NeuN与Active Caspase-3、CNPase与内质网应激途径的标志分子Caspase-12以及CNPase与线粒体途径的标志分子Cytochrome C的共表达。 结果: 大鼠神经功能评分结果显示,ICH组与sham组相比较,mNSS分值明显增高,差别具有显著性(P<0.05),在ICH后1 d,mNSS分值达到峰值(P<0.05),从3 d开始逐渐降低,但仍高于sham组。透射电镜的结果显示,sham组神经纤维及表面的髓鞘形态基本正常,髓鞘保持正常的板层结构。从手术后1d开始,轴索开始出现肿胀,髓鞘发生折叠、皱缩,并且出现分层现象,表现出特征性的“洋葱皮”样外观,同时髓鞘的局部变薄、崩解,局部出现了髓鞘的中断,髓鞘向神经毡内、外折叠,形成胞内和胞外髓样结构,髓鞘的病理改变随时间的延长而加重。免疫印迹的结果显示,ICH组 MBP的表达明显低于 sham组,差别具有统计学意义(P<0.05),其表达从ICH后1 d随时间延长逐渐降低,到ICH后第7 d达到最低值(P<0.05)。少突胶质细胞标记物CNPase和Active Caspase-3的免疫荧光双标记结果显示,ICH各组Active Caspase-3阳性的少突胶质细胞数比sham组明显增多,差别具有统计学意义(P<0.05),Active Caspase-3阳性少突胶质细胞数从ICH后1 d开始增多,在ICH后7 d达到最大值(P<0.05)。而神经元标记物NeuN与Active Caspase-3的免疫荧光双标结果显示,ICH后1 d开始Active Caspase-3阳性的神经元数目明显增多,在ICH后7 d达到峰值(P<0.05),ICH组Active Caspase-3阳性神经元数目与sham组比较有统计学意义( P<0.05),同时免疫印迹的结果显示,内囊区 ActiveCaspase-3的表达从 ICH后1 d开始增加,到第7 d时达到最大值(P<0.05),ICH各组Active Caspase-3蛋白表达水平与sham组比较明显增高,差别有统计学意义( P<0.05)。Caspase-12-CNPase以及Cytochrome C-CNPase免疫荧光双标结果显示,与sham组相比较,ICH组Caspase-12及Cytochrome C阳性的少突胶质细胞数明显增多,差别具有显著性(P<0.05),Caspase-12及Cytochrome C阳性的少突胶质细胞数随时间延长逐渐增多,在第7 d时达到最大值(P<0.05)。同时免疫印迹的结果显示,内囊区Caspase-12及Cytochrome C的蛋白表达水平从ICH后1 d开始逐渐增加,并在ICH后7 d达到峰值(P<0.05), ICH各组Caspase-12与Cytochrome C的表达均明显高于sham组,差别有统计学意义(P<0.05)。 结论: 1. ICH后,内囊区神经纤维出现明显脱髓鞘病变,内囊的脱髓鞘病变可能是导致神经功能障碍的重要原因。 2. ICH后,内囊神经纤维脱髓鞘病变可能是由于神经元及少突胶质细胞凋亡共同作用的结果。 3. ICH后内囊区少突胶质细胞的凋亡可能同时由内质网应激途径和线粒体途径来共同介导的。