论文部分内容阅读
天然产物蜂胶黄酮具有良好的生物学活性,其提取物Pinobanksin-3-acetate(PB3A)可以抑制结肠癌细胞和白血病细胞增殖及诱导凋亡,但对其他肿瘤细胞是否具有增殖抑制作用尚未清楚。本研究检测PB3A对不同类型的多种肿瘤细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用及其分子机制,旨在找出PB3A对各种肿瘤细胞作用强度的异同点,进一步寻找该药作用的靶基因,为抗肿瘤药物的开发和临床应用提供理论依据。本论文工作包括以下两个部分。1、蜂胶黄酮PB3A对人肿瘤细胞和正常细胞L02的增殖抑制作用本研究旨在PB3A对人肿瘤细胞和正常肝L02细胞的增值抑制及诱导凋亡作用,筛查PB3A敏感性肿瘤细胞株,探讨PB3A的抗肿瘤作用。体外培养多种肿瘤细胞,包括肺癌A549细胞、肝癌HepG-2细胞、宫颈癌Hela细胞、乳腺癌MDA-MB-231细胞、食管癌EC-109细胞、胃癌SGC-7901细胞和正常体细胞(肝脏L02细胞),在倒置显微镜下观察不同浓度(20、40、80μg/m L)PB3A作用前后各肿瘤细胞和正常(肝脏L02)细胞的形态学变化。应用MTT比色法,绘制不同肿瘤细胞和L02细胞的生长曲线,不同浓度(10、20、40和80μg/m L)PB3A作用不同时间(24、48、72h)对人肺癌A549细胞等六种肿瘤细胞和肝L02细胞作用后,检测各细胞和L02细胞的增殖并计算IC50值。利用流式细胞仪检测不同浓度(20、40和80μg/m L)PB3A和80μg/mL顺铂诱导各肿瘤细胞和L02系的凋亡率。以SPSS19.0版专用统计分析软件对各组数据进行一般线性模型单变量方差分析,并进行回归分析计算半数抑制浓度(IC50)。结果表明通过倒置显微镜观察发现细胞形态发生显著变化,出现悬浮细胞增多,细胞变成不规则状、皱缩、变圆、细胞胞体缩小、胞膜起泡等随着作用时问的延长和PB3A浓度的增加,细胞发生的形态学变化更为明显。MTT法检测后发现蜂胶黄酮PB3A在体外可显著地抑制肺癌A549等六种肿瘤细胞的增殖(P<0.01),对干细胞L02的增殖抑制作用显著低于对上述肿瘤细胞的作用,抑制作用呈时间和剂量依赖性。(20、40和80μg/mL)范围内PB3A对体外可诱导A549细胞等六种肿瘤细胞和肝细胞L02的凋亡,低浓度PB3A干预组凋亡率明显高于空白组和对照组。最高浓度(80μg/mL)PB3A诱导的A549、HepG-2、Hela、MDA-MB-231、EC-109、SGC-7901细胞和肝L02细胞早起凋亡率分别为37.7%、37.8%、29.5%、23.0%、36.5%、50.02%和18.5%,其中Hela、EC-109、SGC-7901细胞的早期凋亡率明显高于40μg/mL的顺铂处理组的早期凋亡率。PB3A对消化系统肿瘤表现出较强的诱导凋亡作用,诱导凋亡作用呈剂量依赖性。2、采用蛋白质免疫印迹(Western Blotting)法检测胃癌细胞中候选基因的表达热休克蛋白家族HSPA6(heat shock 70kDa protein,HSPA6),生长阻滞和DNA损伤诱生蛋白45(growth arrest and DNA damage inducible protein 45,Gadd45),G蛋白信号转导调节因子2(Regulator of G-protein signaling 2,RGS2),GTP结合丝裂原诱导蛋白(GTP binding protein over expressed in skeletal muscle,GEM)等五条基因蛋白表达的变化,以β-actin做为内参对照,比较目的蛋白表达差异。40μg/mL的PB3A干预24h后FOS、GADD45G、GEM、HSPA6、RGSR在胃癌细胞中Western Blot条带强度的比值平准值分别为0.59±0.16、0.57±0.15、0.87±0.13、0.96±0.11、1.06±0.27,其中与相应的比值平准值对照组相比GADD45G、GEM、HSPA6的蛋白表达强度有显著性差(P<0.05),80μg/mL的PB3A干预组的比值平准值分别为0.97±0.102、0.89±0.10、1.30±0.12、1.19±0.14、1.85±0.15,与相应的对照组比值平准值相比差异有极显著性(P<0.01)。SGC-7901细胞中FOS、HSPA6、Gadd45G、RGSR和GEM蛋白的上调表达与PB3A抑制SGC-7901细胞的增殖及促进凋亡作用密切相关。由于HSPA6基因具有细胞保护作用,因此对外面应激非常敏感,从而对PB3A的抗癌作用可能具有良好的耐药性,限制药物作用。PB3A诱导Gadd45G基因的上调表达机制可能关联与其去甲基化而促使DNA修复的性能密切相关。GEM基因的上调表可能与PB3A的抗癌活性存在一定的内在关系,PB3A诱导FOS和RGS2基因的上调可能激活p38 MAPK信号途径来诱导SGC-7901细胞的凋亡。