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沃尔巴克氏体(Wolbachia)是一种专性细胞内生细菌,能够通过宿主卵细胞质母源遗传给子代,仅以无脊椎动物为宿主,广泛分布于陆生节肢动物和丝状线虫中,能以多种方式参与调控节肢动物宿主的生殖与发育。Wolbachia难以体外培养,不适用传统方法进行分类鉴定。迄今,基于分子序列的鉴定方法将已知Wolbachia分成16个亚型(A-F,H-Q),其中E亚型为营孤雌生殖的跳虫所独有。 “跳虫”为弹尾纲(Collembola)的俗称,是一类古老的小型低等六足动物,亦为土壤动物中的优势类群。跳虫中普遍存在孤雌生殖的现象,两性种群中的性别比例也常偏向雌性。此前,Wolbachia的侵染已在八种跳虫中被报道,其中仅一例为两性物种。这些已知的宿主跳虫绝大多数采集自欧洲,其中仅白符(虫兆)还有一来自美国的种群被检测出了Wolbachia。前人根据16S rRNA与ftsZ基因的系统发生分析认为短角(虫兆)目(Neelipleona)孤雌跳虫的Wolbachia可能是不同于E的新亚型。由于数据有限,跳虫Wolbachia在Wolbachia种内的系统发生地位,以及Wolbachia在跳虫中的传播模式仍不明确。 本研究利用扩增16S rRNA基因片段的检测手段,首次对中国跳虫代表类群中Wolbachia侵染情况进行了筛查,新鉴定出四种含有Wolbachia的跳虫宿主——吉井氏土(虫兆)(Mesaphorurayosii)、后滩滨棘(虫兆)(Thalassaphorura houtanensis)、小裔符(虫兆)(Folsomides parvulus)和短角巨胸白圆(虫兆)(Megalothorax incertus),其中后滩滨棘(虫兆)是首次发现的受Wolbachia侵染的棘(姚)科(Onychiuridae)跳虫。研究表明,上述四种跳虫均为孤雌类群,同一物种的所有受测个体均受单一品系的Wolbachia侵染,而不同种跳虫中的Wolbachia品系互不相同。 Wolbachia特异的多位点序列分型(MLST)系统包含五个蛋白编码看家基因gatB,coxA,hcpA,ftsZ和fbpA,其与wsp基因分型相结合的系统发生分析方法,已广泛运用于Wolbachia的鉴定,但在跳虫类群中尚未见报道。在获得了前述四种中国跳虫类群及一个欧洲孤雌品系白符(虫兆)的Wolbachia基因序列的基础上,本研究首次将MLST分型系统运用于跳虫Wolbachia的系统发生分析,并与16SrRNA+fisZ、wsp等基因的系统发生分析结果进行比较。分析结果表明:孤雌跳虫Wolbachia的遗传差异大,基于16S rRNA与ftsZ基因的系统发生分析无法解析其种下分型,而MLST系统能够有效地鉴定跳虫Wolbachia,并支持包括短角(虫兆)类Wolbachia在内的所有孤雌跳虫Wolbachia构成一个单独的进化枝——E亚型,从而否认了前人提出的短角(虫兆)目Wolbachia构成潜在新亚型的观点,并支持孤雌跳虫Wolbachia具有共同起源的假说。分析结果显示E亚型的MLST系统基因及wsp基因与其他亚型之间均没有基因重组信号,进一步佐证了E亚型的独特性。 通过对本研究鉴定出的受Wolbachia侵染的跳虫扩增WO噬菌体的or f7基因片段并测序分析,发现WO噬菌体侵染在跳虫Wolbachia中较为普遍。此外,通过分子系统发生树比较,发现孤雌跳虫Wolbachia与其宿主的分子系统发生并不一致,暗示Wolbachia在不同种跳虫中可能发生过水平转移。这一现象是前人依据有限的欧洲跳虫类群Wolbachia数据进行分析时所未发现的。通过分析迄今已知的孤雌跳虫Wolbachia数据,本研究发现来自欧洲和中国本土的孤雌跳虫Wolbachia在一定程度上表现出随宿主的地理分布而分化的现象,其中采自中国嵊泗列岛的吉井氏土(虫兆)Wolbachia尤为特化,推测宿主的地理隔离及特殊生境均可能促进Wolbachia积累基因变异,造成E亚型内部显著的遗传差异。 另外,Wolbachia已被证实为白符(虫兆)孤雌生殖行为所必需,但作用机理尚不明确。去除Wolbachia后,白符(虫兆)成虫能够持续产卵,但所产卵不育。为初步探讨白符(虫兆)与其Wolbachia内生菌相互作用的机制,本研究对孤雌生殖的白符(虫兆)丹麦品系进行了抗生素处理,获得了无Wolbachia侵染的成虫以及不育卵。借助显微观察比较不育卵与可育卵胚胎发育中的形态特征,发现不育卵胚胎早期发育速率稍快于正常可育卵,在产卵后24小时左右进入囊胚期,但不再继续发育。利用转录组测序(RNA-seq)技术,考察了不育卵与可育卵,以及产不育卵与产可育卵的成虫之间的基因表达差异。分析结果表明:1)不育卵在卵裂期可能表达了大量异常的mRNA,或从母体中获得了这些异常的mRNA;发育停滞后,仍然有大量基因转录表达,并显著富集在与DNA损伤修复相关的代谢通路中;2)抗生素处理去除Wolbachia后的成虫中,与卵子发生相关的代谢通路显著地受到促进。这些分析结果为进一步研究Wolbachia与宿主跳虫的相互作用,及其对宿主生殖模式的影响,提供了新的研究思路和方向。