小剂量顺铂联合DC疫苗对小鼠宫颈癌移植瘤影响的实验研究

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目的:采用小剂量顺铂联合DC疫苗作用于小鼠宫颈癌移植瘤,观察其对小鼠瘤组织中免疫抑制因子TGF-β1、IL-10的影响,研究小鼠瘤组织中CD3~+T细胞及脾中CD4~+、CD8~+T细胞的浸润情况,探讨使用化疗药物顺铂后是否可提高DC疫苗的抗肿瘤免疫效应。方法:1荷瘤小鼠模型建立:取对数生长期小鼠宫颈癌U14细胞用计数板计数,将浓度调整至1×106个/0.2ml接种于C57BL/6小鼠背部皮下,接种7天后开始抑瘤实验。2DC疫苗制备:取对数生长期U14细胞,经射线照射灭活后反复冻融制备肿瘤细胞抗原。颈椎脱位法处死未荷瘤小鼠,无菌状态下取骨髓细胞,体外经细胞因子rmGM-CSF、rmIL-4等的诱导培养即可得到小鼠骨髓来源的树突状细胞。将小鼠骨髓来源的DC与灭活的肿瘤细胞抗原混合培养,即得到肿瘤抗原致敏的DC疫苗,流式细胞仪鉴定DC表型。3抑瘤实验:将造模成功小鼠随机分成4组,每组10只:对照组10只,腹腔注射生理盐水0.2ml/只,每天1次,连续14天;DC疫苗组10只,给予DC疫苗肿瘤局部注射一次,一周后再注射一次;顺铂组10只,给予顺铂腹腔注射0.2ml/只,每天1次,连续14天;DC疫苗和顺铂联合组10只,给予顺铂腹腔注射0.2ml/只,每天一次,连用3天后,给予DC疫苗肿瘤局部注射一次,一周后重复上述步骤。描绘肿瘤生长曲线,称量瘤重,计算抑瘤率。4免疫组化SP法:检测小鼠瘤组织中TGF-β1、IL-10的表达情况和CD3+T细胞的浸润情况以及脾脏中CD4~+、CD8~+T细胞的浸润情况。采用麦克奥迪医学图像分析软件对组化结果行定量分析,TGF-β1和IL-10用平均光密度值(OD值)表示它们的表达情况,CD3~+、CD4~+、CD8~+T细胞用阳性细胞百分比表示它们所占百分比。5数据分析:采用多样本均数比较的方差分析及两两比较的S-N-K检验,数据分析采用SPSS13.0统计软件完成,以P<0.05为差异有统计学意义。结果:1DC鉴定:倒置显微镜观察,培养第7天的DC可见树突样突起,大部分悬浮生长。流式细胞仪鉴定,CD11c~+CD86~+DCs纯度为89%,表明为典型成熟DCs。2各组荷瘤小鼠的生长状态:接种瘤细胞后1~10天,各组小鼠生长状态均良好,15天后对照组小鼠体重开始下降,出现活动量少、消瘦等表现;顺铂组小鼠用药一周后,进食明显减少,用药两周后,发现精神萎靡、活动迟缓等表现;DC疫苗组和联合组小鼠状态较好,体重无明显下降趋势。3DC疫苗和顺铂对小鼠移植瘤的影响:接种瘤细胞后1~10天,各组小鼠移植瘤生长基本相同;11~15天,对照组小鼠移植瘤生长快于其他组,联合组小鼠移植瘤生长最慢;16~24天,对照组小鼠移植瘤生长明显快于其他三组,而顺铂组和联合组小鼠移植瘤开始变小,DC疫苗组小鼠移植瘤于第18天开始变小,其中联合组小鼠移植瘤变小最明显。对照组、DC疫苗组、顺铂组和联合组移植瘤重分别为(3.159±0.005)g、(2.794±0.006)g、(1.976±0.006)g、(1.736±0.005)g,各用药组瘤重均低于对照组(P<0.05),各用药组组间两两比较瘤重差异均有统计学意义(P<0.05);按抑瘤率计算公式得出,DC疫苗组、顺铂组、联合组抑瘤率分别为11.55%、37.45%、45.08%,联合组抑瘤率最高,其次为顺铂组、DC疫苗组,三组组间两两比较抑瘤率差异均有统计学意义(P<0.05)。4免疫组化结果:对照组、DC疫苗组、顺铂组、联合组中TGF-β1的OD值分别为(0.467±0.003)、(0.466±0.003)、(0.137±0.004)、(0.140±0.003);IL-10的OD值分别为(0.477±0.006)、(0.474±0.004)、(0.136±0.004)、(0.138±0.005);CD3+T细胞所占百分比分别为(0.203±0.007)、(0.357±0.005)、(0.200±0.008)、(0.502±0.009);CD4+T细胞所占百分比分别为(0.071±0.007)、(0.305±0.004)、(0.066±0.006)、(0.311±0.007);CD8+T细胞所占百分比分别为(0.162±0.003)、(0.396±0.003)、(0.159±0.005)、(0.398±0.005)。顺铂组和联合组TGF-β1、IL-10的表达量分别与对照组、DC疫苗组相比,差异均有统计学意义(P<0.05);而顺铂组与联合组相比、DC疫苗组与对照组相比,差异均无统计学意义(P>0.05)。DC疫苗组和联合组CD3~+T细胞所占百分比分别与对照组、顺铂组相比,差异均有统计学意义(P<0.05);而顺铂组与对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05),DC疫苗组与联合组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。DC疫苗组和联合组CD4~+、CD8~+T细胞所占百分比分别与对照组、顺铂组相比,差异均有统计学意义(P<0.05);而DC疫苗组与联合组相比、顺铂组与对照组相比,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:1本研究观察到注射U14细胞至C57BL/6小鼠数量达1×106及以上时可形成肿瘤,少于此量时较难或不形成肿瘤。2小剂量顺铂作用于荷瘤小鼠,可以下调肿瘤组织中免疫抑制因子TGF-β1及IL-10的表达,减轻肿瘤微环境中的免疫抑制。3DC疫苗注射到荷瘤小鼠肿瘤局部,能够提高肿瘤局部的CD3+T细胞的数量;先用小剂量顺铂作用于荷瘤小鼠,再肿瘤局部注射DC疫苗,能够明显提高肿瘤局部CD3~+T细胞的数量,且下调肿瘤微环境中免疫抑制因子TGF-β1及IL-10的表达,从而增强宿主对DC疫苗的敏感性,启动宿主主动性抗肿瘤免疫。4DC疫苗作用于荷瘤小鼠,能够上调小鼠脾脏中CD4~+、CD8~+T细胞的数量,提高小鼠外周免疫系统的抗肿瘤免疫应答能力,产生良好的治疗效果。
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