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背景类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是最常见的自身免疫性风湿性疾病之一,它主要通过复杂的多系统炎症性因子影响关节功能。如果不及时治疗,RA患者会出现关节畸形、致残以及类风湿性心脏病等。RA发病机制目前并不明确,学者一致认为与遗传因素、环境因素、病毒感染及自身免疫功能紊乱有关。多种因素引起机体固有免疫及适应性免疫应答增强,进一步引起关节损伤。其中,调节性T细胞和辅助性T细胞17的平衡破坏在RA疾病发生发展中起重要作用。Treg细胞在RA患者外周血比例减少,且分泌较少具有负性调节作用的细胞因子IL-10。Treg细胞可影响多种细胞功能,如单核细胞、树突状细胞、B细胞等。RA患者体内B细胞呈现高活化状态,分泌较多的IgM和IgG型抗体,这些抗体又被称做类风湿因子。RA患者外周血Treg细胞减少与B细胞过度活化是否有关,且相互影响的机制如何尚未见文献报道。本课题拟采用流式、酶联免疫等技术,分析RA患者外周血Treg细胞比例、IL-10、IgM及IgG含量,并在体外条件下证明Treg是否通过分泌IL-10抑制B细胞向浆细胞分化,进而抑制自身免疫性抗体分泌。目的本课题拟通过实验明确RA患者Treg细胞比例、IL-10、IgM和IgG含量,并在体外条件下证明Treg通过分泌IL-10抑制B细胞分化及自身抗体分泌,从而揭示类风湿性关节炎患者外周血调节性T细胞减少,无法通过分泌足量IL-10抑制自身抗体分泌是其疾病发生发展的重要因素之一,也为RA治疗提供理论依据和重要靶点。方法1.研究对象:参照美国风湿病学会1987年修订的RA分类标准,选择本医院收治的RA患者20例。对照组为同期该院体检健康人群20例,注意尽量保证年龄、性别相匹配。2.样本收集和处理:收集RA患者和HC对照者空腹血样10ml,以肝素锂抗凝,分离血浆冻存,并采用Ficoll分离法分离外周血单个核细胞,备用。3.血浆IL-10水平的检测:采用人IL-10 ELISA检测试剂盒,检测血浆IL-10含量。4.血浆IgM、IgG浓度检测:采用人IgM、IgG ELISA检测试剂盒,检测血浆IgM、IgG含量。5.CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg细胞比例检测:采用多色荧光抗体结合流式细胞术检测并分析样本中CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg细胞比例。6.Treg细胞抑制B细胞分化:采用流式分选RA患者CD4~+CD25~+T细胞和na?ve B细胞,两者共培养后,检测CD19~+IgD~-CD38~+CD27~+浆细胞比例和IgM、IgG mRNA表达水平。7.IL-10抗体阻断Treg细胞抑制B细胞分化:在CD4~+CD25~+T细胞和na?ve B细胞共培养时,加入IL-10抗体,检测CD19~+IgD~-CD38~+CD27~+浆细胞比例和IgM、IgG mRNA表达水平。8.统计学方法:计量数据以均数加减标准差((x|-)±s)表示,两组间差异比较采用t检验,各组数据阳性率比较采用卡方检验,相关性采用pearson相关分析。检验水准α=0.05,P<0.05为差异有统计学意。结果1.标本分组情况:RA组共计20例,HC组共计20例,性别、年龄无统计学差异。2.RA患者外周血IL-10含量为(32.04±5.96)pg/ml,低于健康对照者(57.68±13.72)pg/ml,且有显著统计学差异。3.RA患者外周血IgM含量为(23.25±7.85)IU/ml,高于健康对照者(13.63±3.44)IU/ml,RA患者外周血IgG含量为(26.89±8.67)IU/ml,高于健康对照者(13.39±3.96)IU/ml,均有显著统计学差异4.RA患者外周血CD4~+CD25~+Foxp3~+T细胞比例为(5.04±1.58)%,与HC对照组(9.86±3.89)%相比较,比例明显降低,且有统计学差异。5.在未加入Treg细胞时,浆细胞比例为(4.31±2.51)%,加入Treg细胞时,浆细胞比例为(1.83±1.23)%,后者显著低于前者,且有统计学差异;未加入Treg细胞时,B细胞IgM和IgG mRNA表达量分别为(2.01±0.57)倍和(1.97±0.52)倍,均高于加入Treg细胞组B细胞IgM和IgG mRNA表达量,经配对T检验均有统计学差异。6.未加入IL-10抗体时,浆细胞比例为(1.83±1.23)%,加入IL-10抗体时,浆细胞比例为(4.73±1.95),后者显著高于前者且有统计学差异;加入IL-10抗体时,B细胞IgM和IgG mRNA表达量分别为(2.17±0.80)倍和(2.08±0.85)倍,均高于未加入IL-10抗体组B细胞IgM和IgG mRNA表达量,经配对T检验均有统计学差异。结论1.RA患者外周血Treg细胞比例及IL-10含量降低、IgM、IgG含量增高;2.Treg细胞可通过IL-10抑制B细胞向浆细胞分化,进而抑制自身免疫性抗体分泌,揭示RA患者外周血Treg减少,无法通过分泌足量IL-10抑制自身抗体分泌是其疾病发生发展的重要因素之一。