猪囊尾蚴抗原cC1的高效表达及其重组耻垢分枝杆菌疫苗的构建

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目的:(1)高效可溶性原核表达并纯化猪囊尾蚴抗原cC1;?(2)构建表达抗原cC1的重组耻垢分枝杆菌疫苗。  方法:(1)将重组质粒pET28a-cC1转化到表达宿主菌E.coliBL21(DE3)中,挑取单个菌落,培养扩增至OD600约为0.6,加入诱导剂IPTG,同时设空载体质粒及未诱导的菌株为对照,以SDS-PAGE电泳分析表达产物。对诱导时间和IPTG浓度进行分析,优化表达条件。在优化的条件下,大量培养含pET28a-cC1的菌株,IPTG诱导后超声波破菌,分离上清和沉淀,上清经His亲和层析柱纯化,再通过AKTA explorer100型快速液相蛋白层析分离系统进一步纯化并检测其纯度,采用SDS-PAGE电泳和Wester-blotting对目的蛋白进行分析和验证。(2)提取pET28a-cC1质粒DNA用XhoI和BamHI双酶切,用Kelow酶补平XhoI酶切末端,同时提取pMV261穿梭质粒载体,用HindIII和BamHI双酶切,用Kelow酶补平HindIII酶切末端,纯化后的酶切产物以T4连接酶连接,构建pMV261-cC1穿梭质粒,测序验证正确后,将 pMV261-cC1穿梭质粒经电穿孔法转化耻垢分枝杆菌,构建重组耻垢分枝杆菌疫苗,挑取阳性菌落,培养扩增经热诱导后以 SDS-PAGE电泳分析蛋白表达,并以抗cC1小鼠血清对表达蛋白进行Wester-blotting鉴定。  结果:(1)采用不同浓度的诱导剂和不同的诱导时间对 pET28a-cC1的诱导表达条件进行优化,通过SDS-PAGE电泳分析表达产物,结果为0.05 mmol/LIPTG诱导6 h时可达最大的表达量,再加大诱导剂浓度和延长诱导时间,蛋白表达量不仅未见增加,反而呈下降趋势;超声破菌后分别 SDS-PAGE电泳分析取上清和沉淀,结果表明重组蛋白在37℃时大量表达,且主要为可溶性表达;表达量高达菌体总蛋白的60%;优化条件下大量表达,经His柱纯化,AKTA explorer100型快速液相蛋白层析分离系统检测其纯度,蛋白纯度达到94%。表达的分子量约为40 kD的可溶性融合蛋白能被囊虫病患者血清识别。(2)构建的重组穿梭载体经酶切、测序验  证正确;构建的重组耻垢分枝杆菌疫苗热诱导后经SDS-PAGE电泳分析和western-bloting验证,在40 kD处有蛋白表达,与预期值相符,表明cC1抗原基因在耻垢分枝杆菌中表达。  结论:  (1)成功优化了cC1蛋白高效可溶性原核表达条件,获得了纯度达94%且具备抗原性的cC1蛋白。  (2)成功构建了含有cC1基因耻垢分枝杆菌疫苗。
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