论文部分内容阅读
目的： 肿瘤抑制基因的表达沉默在胃癌的发生发展中起重要作用，而DNA甲基化是肿瘤抑制基因表达沉默的主要原因之一。本文探讨胃癌中SOX11基因的表达水平及与启动子区DNA甲基化的关系，以及启动子区DNA甲基化的改变在临床中可能的应用价值。 材料与方法： 一、细胞株和胃癌及对应的癌旁非癌组织 人正常胃粘膜上皮永生化细胞株GES-1和5株胃癌细胞株(SGC7901，BGC823，AGS，MKN45，HGC27)，胃癌组织和对应的癌旁非癌组织共89对。 二、实时定量RT-PCR 上述6株细胞株培养收获后以TRIzol处理并用氯仿-异丙醇提取RNA，用DNaseⅠ去除RNA中的DNA，然后行实时定量RT-PCR检测SOX11基因的表达，用2-△△Ct法分析实时定量PCR数据，以GES-1中的表达量为相对标准，其他5株细胞株中的表达量与其比较。 三、甲基化特异性PCR DNA采取经典的有机溶剂法提取，然后行重亚硫酸钠修饰、纯化、回收，回收的DNA用甲基化特异性引物和非甲基化特异性引物分别行甲基化特异性PCR，对PCR结果进行电泳分析，判别每一个样本中SOX11基因启动子区的DNA甲基化状态，分非甲基化(U)、部分甲基化(P)、高甲基化(M)三种状态。 四、药物干预实验 以去甲基化药物5-Aza-dC和/或组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA对MKN45细胞株进行药物干预，以不加任何一种药物的MKN45作为对照组，其他应用任何一种药物的为实验组，完毕提取RNA并行实时定量RT-PCR检测SOX11基因的表达，并且检测细胞增殖的变化，以无药物干预的对照组为相对标准，其他实验组与其比较，用2-△△Ct法分析实时定量PCR数据，根据吸光度(A)值计算增殖率，增殖率(％)=（实验组A值-空白组A值）/（阴性对照组A值-空白组A值）×100％。 五、统计学分析 将癌组织和癌旁非癌组织中SOX11基因的启动子区DNA甲基化状态进行统计学分析，癌组织中SOX11基因的启动子区DNA甲基化状态与其病理指标行统计学分析，实验数据应用SPSS19.0统计软件包建立数据库，进行卡方检验。P＜0.05时，有显著性差异;P＞0.05时，无显著性差异。 结果： 1、SOX11基因在5株胃癌细胞株中的表达均下调，去甲基化药物可诱导SOX11基因在MKN45中重新表达，并且可以抑制MKN45的增殖。 2、SOX11基因的启动子区DNA在GES-1中为非甲基化，在SGC7901中为部分甲基化，而在其它4株胃癌细胞株中均为高甲基化。 3、SOX11基因的启动子区DNA在胃癌组织和相应的癌旁非癌组织中的甲基化状态存在明显差异，前者启动子区DNA甲基化频率明显高于后者(55.1％vs.7.9％，P＜0.001)。癌组织中SOX11基因的启动子区DNA甲基化状态与大体类型(BorrmannⅠ+BorrmannⅡvs.BorrmanⅢ+BorrmannⅣ，54.5％vs.55.1％,P＜0.05)、浸润深度（T1+T2vs.T3+T4，49.6％vs.59.6％，P＜0.05）、组织学分化（高分化和中分化vs.低分化，44.8％vs.60.0％，P＜0.05）有统计学意义。 结论： SOX11基因在胃癌中因启动子区的DNA高甲基化引起表达沉默;此沉默可受去甲基化药物5-Aza-dC调控而恢复表达;而且其启动子区的DNA甲基化状态与胃癌的大体类型、浸润深度和组织学分化密切相关。