研究背景和目的食管癌是一种发病率较高的消化道恶性肿瘤,其发病率常年居高不下。食管鳞状细胞癌和食管腺癌分别是食管癌最主要的两大组织类型。在我国的食管癌病例中,绝大多数表现为食管鳞状细胞癌,食管腺癌则相对罕见。食管癌患者早期症状不明显,就诊时多已进展至为中晚期。因此食管癌病变发生初期的早期发现、早期诊断、早期治疗已成为目前临床和基础的重要研究课题。目前,除了依靠临床诊断、手术等治疗水平的提高,以基因靶向治疗为核心生物治疗可能成为重要的治疗方向。然而,食管癌缺乏特异性治疗靶标而无法获得良好效果。因此,本研究试图通过深入探索食管癌发病机制,寻找可能的基因靶点,为食管癌的靶向治疗提供实验依据和理论基础。Shp2分子发现于20世纪90年代早期,是一种带有两个SH2结构域的非受体型酪氨酸磷酸酶。Shp2通过与多种信号通路交互,在细胞增殖、分化等方面发挥作用。在肿瘤研究领域,人们最先在白血病中阐述了Shp2分子的原癌基因作用。近年来,人们逐步开始探究Shp2分子在实体瘤中所发挥的作用。研究者相继报道了Shp2分子与乳腺癌、胃癌、肺癌等实体肿瘤发生发展之间的密切联系。初步的成果揭示了,Shp2分子通过对多种肿瘤信号通路的激活,在肿瘤中发挥原癌基因作用。同时多个文献报道了Shp2在部分肿瘤发生发展中的抑癌作用,提示Shp2在肿瘤发生发展中具有两面性。但在食管癌中,Shp2的作用及其机制尚未明确。本课题试图通过一系列临床标本检测及细胞功能学研究,观察Shp2在食管鳞状细胞癌中的表达变化及其在食管鳞癌细胞生物学功能中的作用,并进一步探究Shp2影响食管鳞状细胞癌生物学功能的潜在机制。同时通过分析Shp2在食管鳞癌细胞化疗耐药性中的作用,探讨Shp2在食管鳞癌联合化疗中的价值,最终为食管鳞癌治疗提供新的靶点。研究方法1.免疫组织化学染色检测食管鳞状细胞癌组织及对应癌旁组织石蜡标本中Shp2蛋白表达水平,分析不同组织中Shp2蛋白表达差异;蛋白质免疫印迹(Western-blot)检测食管鳞状细胞癌及对应癌旁正常组织的新鲜组织标本中Shp2蛋白表达水平,分析癌组织中Shp2蛋白表达量变化;提取美国癌症基因组图谱计划(TCGA)数据库中食管鳞状细胞癌Shp2表达数据与预后信息,分析Shp2表达水平与患者预后之间的联系;2.使用慢病毒系统介导的Shp2-shRNA转染食管鳞状细胞癌Eca109细胞株,干扰Eca109细胞中Shp2表达,分别建立Eca109对照组(Control)和Shp2干扰组(shShp2)稳定细胞系;Western-blot检测Eca109细胞Control组及shShp2组Shp2蛋白表达变化,验证转染效率;对Eca109细胞Control组及shShp2组进行CCK-8检测试验、克隆形成实验检测Shp2干扰对Eca109细胞体外增殖、克隆形成能力的影响;Eca109细胞Control组及shShp2组进行裸鼠皮下成瘤实验,观察Shp2干扰对Eca109细胞体内成瘤能力及移植瘤体内生长的影响;3.顺铂分别处理Control组及shShp2组Eca109细胞,CCK-8试验分别检测顺铂用药24、48、72、96小时后细胞活力,分析Shp2干扰对Eca109化疗耐药性的影响;顺铂、5-氟尿嘧啶分别处理Control组及shShp2组Eca109细胞,Annexin V凋亡检测试剂盒处理后流式检测分析Shp2在化疗诱导的细胞凋亡中的作用;Western-blot检测Control组及shShp2组Eca109细胞化疗耐药相关基因ABCG2、Nanog表达水平,分析Shp2表达影响Eca109化疗耐药性的潜在分子机制;Transwell迁移试验分析Shp2表达干扰对食管鳞癌细胞迁移能力的影响;4.Western-blot和免疫组织化学染色检测Eca109细胞及裸鼠移植瘤Shp2干扰对下游信号Stat3磷酸化(p-Stat3)水平的影响;免疫组织化学染色检测人食管鳞状细胞癌组织标本中Shp2蛋白表达与Stat3磷酸化水平,分析Shp2表达与p-Stat3磷酸化之间的联系;Real time-PCR检测Control组及shShp2组Stat3下游靶基因Cyclin D1、Survivin表达水平,分析Shp2干扰后Eca109细胞相关基因表达变化。研究结果1.食管鳞状细胞癌组织免疫组化检测显示Shp2蛋白表达水平低于对应癌旁组织,组织蛋白Western-blot检测显示食管鳞状细胞癌中Shp2蛋白表达量低于癌旁正常组织,提示食管鳞癌组织中Shp2表达显著降低,提示Shp2低表达可能与食管鳞状细胞癌发生密切相关;对TCGA数据库中食管鳞状细胞癌患者预后资料进行统计分析,结果显示Shp2低表达组患者总体生存期显著差于高表达组,提示Shp2低表达与食管鳞状细胞癌预后有关;2.成功建立食管鳞状细胞癌Eca109细胞株Shp2干扰稳定细胞系,Shp2干扰提高了Eca109细胞的体外增殖能力及克隆形成能力,提示Shp2可能在食管鳞癌细胞体外中发挥抑制作用;通过裸鼠皮下成瘤实验,发现Shp2干扰可以显著增强Eca109细胞在裸鼠体内的增殖速度,提示Shp2表达抑制了食管鳞癌细胞的体内增殖能力;3.顺铂药物毒性实验发现Shp2干扰可以提高Eca109的生存能力;流式凋亡检测发现Shp2干扰后Eca109细胞凋亡抑制,对顺铂、5-氟尿嘧啶耐药性增强;Western-blot检测发现Shp2干扰细胞系中ABCG2、Nanog表达水平显著上调;Transwell迁移试验发现Shp2表达对细胞迁移能力没有显著影响。4.通过对Shp2干扰Eca109细胞系及对照细胞系p-Stat3水平进行检测,发现Shp2干扰后p-Stat3水平明显上调;对裸鼠移植瘤进行连续切片免疫组织化学染色发现Shp2低表达区域p-Stat3水平上调,反之Shp2高表达区域p-Stat3水平下调,提示Shp2可能通过抑制Stat3磷酸化发挥作用;同样的,对食管鳞状细胞癌标本中Shp2表达与Stat3磷酸化(p-Stat3)水平分析发现,Shp2表达与p-Stat3水平呈负相关;Real time-PCR检测发现Shp2干扰后Eca109细胞中Stat3下游靶基因Cyclin D1、Survivin表达水平显著上调。结论:综合Shp2在肿瘤中的多项研究,我们发现Shp2在肿瘤发生发展中的作用具有两面性——在部分肿瘤中发挥促癌作用同时在一些肿瘤中抑制肿瘤生长,但Shp2在食管鳞状细胞癌中的作用尚无研究报道。本课题研究发现Shp2在食管鳞状细胞癌组织中表达低于癌旁正常组织,并且食管鳞状细胞癌中Shp2低表达与患者预后较差显著相关,提示Shp2在食管鳞状细胞中可能发挥抑癌作用。细胞功能学研究显示Shp2抑制了食管鳞癌细胞的体外增殖能力、克隆形成能力及体内移植瘤生长速度。另外,Shp2抑制食管鳞癌细胞化疗抵抗相关基因表达,促进化疗诱导的细胞凋亡,显著降低食管鳞癌细胞的化疗耐药性。Shp2对食管鳞癌细胞迁移能力无显著影响。Shp2干扰细胞系中发现Stat3磷酸化水平显著增高以及Stat3靶基因表达上调,提示在食管鳞癌中Shp2通过对Stat3的去磷酸化并下调靶基因表达发挥抑制作用。综上所述,Shp2在食管鳞癌发展过程中发挥抑癌作用,可能是食管鳞癌的预后标志物和潜在临床治疗靶点。