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背景:NEK2属细胞周期相关的丝/苏氨酸蛋白激酶,参与组装中心体、调控中心体分离及纺锤体组装检查点信号调节过程等,维持基因组的稳定。NEK2的表达异常和功能紊乱将导致肿瘤的发生,高表达的NEK2与肿瘤恶性进展、肿瘤耐药及肿瘤的不良预后相关。因此,NEK2的异常表达可以用于指征肿瘤进程和疾病预后,是一个潜在的具有巨大开发前景的分子治疗靶标。前期研究中,我们设计合成的NEK2抑制剂对包括胃癌和乳腺癌在内的多种肿瘤具有很强的体内外抗肿瘤活性,作用的强弱与高表达NEK2和KDM5B相关。NEK2抑制剂不仅下调NEK2的表达,对KDM5B的下调作用,提示NEK2可能直接或间接参与调控KDM5B发挥生物学功能,而该发现未见报道,值得深入探讨。目的:本课题旨在通过构建NEK2沉默与过表达稳转细胞株,研究NEK2对乳腺癌、胃癌发生发展的影响;确证前期研究中NEK2对KDM5B的调控作用;进一步研究NEK2对KDM5B的具体分子调控机制。以期明确KDM5B在靶向抑制NEK2抗乳腺癌及胃癌活性中的重要作用,进而发现介导乳腺癌、胃癌发生发展的新信号通路,为抗肿瘤新药的研发提供新的思路。方法:采用生物信息学方法分析NEK2表达水平与乳腺癌病理进程、预后、病人生存期等的相关性;免疫共沉淀实验用于检测NEK2与KDM5B之间的关系;分别采用CRISP/cas9系统、p-babe载体系统构建NEK2沉默及NEK2过表达的乳腺癌稳转细胞株;分别采用tet-on、tet-off慢病毒转染系统构建NEK2沉默及NEK2过表达的胃癌单克隆稳转细胞株;Western blot法检测细胞蛋白水平变化;CCK-8实验、克隆形成实验检测肿瘤细胞增殖情况;创伤愈合实验、Transwell实验检测肿瘤细胞迁移情况;PI染色法、Annexin V-FITC法分别检测细胞周期和凋亡;MTT实验用于检测肿瘤细胞对化疗药敏感性;裸鼠体内成瘤实验观察干扰NEK2条件下的肿瘤生长情况。结果:(1)在乳腺癌中,NEK2的高表达与疾病分期、不良预后相关。沉默NEK2抑制乳腺癌MDA-MB-468细胞增殖和迁移,导致G2/M阻滞;而过表达NEK2促进乳腺癌MCF-7细胞增殖和迁移,不影响细胞周期。NEK2的敲除导致NEK2蛋白水平的降低,同时也显著降低KDM5B的表达,增加H3K4me3的表达;而MCF-7细胞NEK2的过表达,KDM5B蛋白水平也随之升高,H3K4me3的表达降低。免疫共沉淀实验表明NEK2与KDM5B并无直接相互作用,进一步的研究发现,NEK2调节KDM5B/H3K4me3的机制主要是通过激活β-catenin/Wnt信号通路。沉默NEK2抑制桥梁蛋白β-catenin、c-Myc的表达,从而减少KDM5B的转录与表达。过表达NEK2激活β-catenin/Wnt信号通路,β-catenin、c-Myc表达增加,KDM5B表达随之增加,H3K4去甲基化增加。MCF-7 OE-NEK2细胞经cMyc抑制剂处理后,c-Myc及其下游KDM5B蛋白表达显著降低,H3K4me3的表达增加,不影响上游β-catenin表达,但对NEK2的表达有微弱抑制。MCF-7OE-NEK2细胞经KDM5B抑制剂处理后,KDM5B表达显著降低,H3K4me3表达增加,不影响上游β-catenin、c-Myc蛋白表达。c-Myc和KDM5B抑制剂能在一定程度上抵消或缓解过表达NEK2对KDM5B的调控作用。研究结果表明,NEK2通过激活β-catenin/Wnt信号通路,调节KDM5B/H3K4me3表达从而影响乳腺癌细胞的增殖。(2)在多个胃癌细胞中,NEK2表达量均较高。沉默NEK2抑制MGC-803胃癌细胞的增殖和转移,导致G2/M阻滞及细胞凋亡,增加胃癌细胞对ABC底物的化疗药的敏感性,裸鼠体内肿瘤生长减慢;过表达NEK2促进SNU-1胃癌细胞的增殖,增加对化疗药的耐药程度,裸鼠体内肿瘤生长加快。在细胞水平上,沉默NEK2抑制P38/MAPK经典信号通路的p-P38、p-AKT、pERK蛋白表达,而过表达NEK2后,p-P38、p-AKT、p-ERK蛋白表达显著增加。NEK2通过激活P38/MAPK信号通路调节胃癌生长。裸鼠胃癌组织Western blot研究发现,沉默NEK2抑制β-catenin、c-Myc蛋白表达,KDM5B表达显著降低,H3K4me3表达增加。研究结果表明,在胃癌中,NEK2也可以通过激活β-catenin/Wnt信号通路,调节KDM5B/H3K4me3表达从而影响胃癌细胞的增殖。结论:本课题第一次系统地揭示了NEK2在乳腺癌、胃癌发生发展中的重要的作用。沉默NEK2抑制乳腺癌与胃癌细胞的增殖、迁移及细胞周期阻滞,增加胃癌细胞对化疗药的敏感性。过表达NEK2促进乳腺癌与胃癌细胞的增殖及迁移,促进胃癌细胞对化疗药的耐药。NEK2可通过激活β-catenin/Wnt信号通路调节KDM5B/H3K4me3的蛋白表达,影响乳腺癌与胃癌的生长与迁移。本研究第一次系统地揭示了NEK2在乳腺癌、胃癌细胞增殖、转移、耐药中所起的作用,并首次发现NEK2对KDM5B的调控作用及其机制,阐明了NEK2在肿瘤发生发展过程中的重要性,具有原始创新性意义,为新型抗肿瘤药物的研发提供新的靶点和思路。