酪酸梭菌的分离鉴定及其对结肠癌细胞的作用与机制探讨

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目的:肠道菌在人体内发挥重要的生理作用,探明肠道菌群的作用对人体有着十分重要的意义。运用TSN培养基,从健康正常人的粪便中分离培养、筛选出1株肠道菌株,并采用相关的方法对其进行分子鉴定为酪酸梭菌(Clostridium butyricum, CB)。经鉴定的CB作用于结肠癌SW-480细胞并观察其对细胞的影响,测定细胞内凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达情况,进一步探讨CB抗结肠癌细胞生长的可能机制。方法:收集健康成年人新鲜粪便40例,分离培养CB;通过对该菌的细菌培养、菌落形态观察、革兰染色镜检、分离纯化培养、生化试验进行形态学的鉴定,并结合16S rDNA方法进行了分子鉴定。结肠癌SW-480细胞与经鉴定的CB以不同浓度分别为1.5×103,1.5×104,1.5×105,1.5×106,1.5×107,1.5×108CFU/ml相互作用,经CB作用24h、48h、72h、96h后,用CCK-8试剂盒检测该菌对结肠癌细胞的增殖抑制作用并筛选出作用比较明显的浓度(1.5×106,1.5×107,1.5×108CFU/ml)和有效作用时间用于后续实验;TEM观察作用后细胞超微结构变化;48h后经FCM测定细胞凋亡率;Caspase试剂盒检测SW-480细胞中Caspase-3和Caspase-9的活性。提取细胞总蛋白,Western印迹的方法测定与线粒体凋亡相关的两种主要蛋白Bcl-2和Bax的表达。所有数据通过采用Graph Pad Prism5.0软件进行双因素方差分析,绘图,P<0.01有统计学意义。结果: CB经厌氧培养后菌落边缘不整齐,乳白色,表面轻度凸起,单个存在,很少成片,菌落较大,整个菌落有侵袭性,在培养36小时后该菌向培养基下生长并产生大量的气体符合文献描述特性。光镜下革兰染色蓝紫色,呈梭状,单个或成对排列,次极端有芽胞;生化试验中,只有明胶液化试验和吲哚试验阴性,其它均为阳性,符合文献描述,根据16S rDNA分子鉴定结果,得知此菌是一株具有特殊生理作用的CB。正常对照和浓度分别为1.5×103、1.5×104、1.5×105、1.5×106、1.5×107、1.5×108CFU/ml的CB作用于结肠癌细胞后CCK-8显示,CB组24h、48h、72h、96h对细胞的抑制作用均高于正常对照组,P<0.01,有统计学意义;电镜结果显示,1.5×107、1.5×108CFU/ml的CB作用结肠癌细胞48h后可以看到细胞膜、细胞器皱缩,胞质致密,表面粗糙,核染色质聚集浓缩边集,细胞内的部分胞质和胞核呈现分叶状突起并且形成多个凋亡小体,即并与胞体分离,含核碎片和细胞器成分的典型的细胞凋亡形态特征,而正常对照组未见明显异常;48h后CB组细胞凋亡率高于正常对照组, P<0.01,结果有显著性差异;48h后CB组:Caspase-9、Caspase-3的活性表达均高于正常对照,1.5×107和1.5×108CFU/ml CB处理后,Caspase-9、Caspase-3的活性分别提高58.8%、92.3%和68.3%、89.5%,P均小于0.01,有显著性差异;蛋白表达结果显示:CB作用于癌细胞48h后,Bax的蛋白表达量均显著高于正常对照组,P<0.01,有统计学差异;与正常对照组相比,Bcl-2的蛋白表达量减少, t=6.1,P<0.01,有显著的统计学差异,均有统计学意义。结论:结肠癌的增殖抑制机制与酪酸梭菌的作用有一定关系,在某种程度上,酪酸梭菌自身所具有的成分或者一定环境下产生的代谢产物抑制了结肠癌细胞的生长,主要涉及到增强Caspase-3和Caspase-9的活性,上调Bax和下调Bcl-2蛋白的表达,启动了凋亡通路,进而诱导SW-480细胞凋亡,导致肿瘤细胞凋亡的发生。
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