论文部分内容阅读
研究背景肝癌作为一种常见的消化系统恶性肿瘤在我国高发，其侵袭能力强、易发生肝内外转移、病死率高，严重的威胁着人们的生命健康。以手术治疗为主的综合性治疗方法不断的完善，但肝癌术后复发率仍较高，总体预后较差。因此，肝癌的预防治疗等相关研究刻不容缓，而从肝癌的侵袭与转移入手，阻断其发生、发展的途径也是行之有效的手段之一。骨桥蛋白(Osteopontin，OPN)是一种与肿瘤的发生、发展过程中息息相关的生物分子，许多研究提示该蛋白与肿瘤的侵袭转移及预后密切相关，但目前OPN在肝癌侵袭转移过程中的作用机制仍不明确。目的本研究采用siRNA干扰的方法处理人肝癌细胞，通过靶向沉默骨桥蛋白的基因表达，初步探讨骨桥蛋白对肝癌细胞侵袭的影响及其分子调控机制。方法本研究首先采用细胞体外侵袭实验观察正常肝细胞及3种不同肝癌细胞系侵袭能力的强弱变化趋势，应用RT-PCR和Western-blot方法检测非肿瘤肝细胞（HL-7702）和不同肝癌细胞系（HepG2、SMMC-7721和MHCC97H）中OPN的表达；其次，采用siRNA干扰的方法处理人肝癌细胞（HepG2和MHCC97H），采用RT-PCR和Western-blot方法检测siRNA干扰后OPN的表达情况，用细胞体外侵袭实验观察沉默OPN基因表达后对人肝癌细胞HepG2和MHCC97H侵袭能力的影响；最后，用Western-blot和ELISA方法检测通过siRNA干扰后人肝癌细胞（HepG2和MHCC97H）中MMP-2及VEGF蛋白表达与活力的变化情况。结果1.细胞体外侵袭实验表明：通过Transwell小室观察HL-7702、MHCC97H、SMMC-7721、HepG2四种细胞的侵袭能力，可以发现肝癌细胞系的侵袭能力明显高于正常肝细胞系HL-7702，而3种肝癌细胞系侵袭能力的强弱分别为：MHCC97H＞SMMC-7721＞HepG2。RT-PCR和Western-blot方法检测结果显示，在肝癌细胞系（HepG2、SMMC-7721和MHCC97H）中OPN的表达明显高于非肿瘤肝细胞系（HL-7702），并且随着肝癌细胞系侵袭能力的逐渐增强，OPN的mRNA和蛋白表达逐渐增高，差异有统计学意义（P<0.05)。2. RT-PCR和Western-blot方法检测结果显示：在HepG2和MHCC97H中转染siRNA-OPN，能够有效抑制OPN的mRNA和蛋白的表达。Transwell体外侵袭实验表明，siRNA-OPN也能有效抑制HepG2和MHCC97H细胞系的侵袭能力，差异有统计学意义（P<0.05)。3. Western-blot方法检测结果显示：在HepG2和MHCC97H中转染siRNA-OPN后，MMP-2和VEGF的蛋白表达降低。ELISA检测结果显示，在HepG2和MHCC97H中转染siRNA-OPN后，MMP-2和VEGF的蛋白活力水平呈现显著降低，差异具有统计学意义（P<0.05)。结论OPN在肝癌细胞侵袭转移过程中起着非常重要的作用，其作用机制可能是通过调控MMP-2和VEGF的蛋白表达和活性来参与肝癌细胞的侵袭，OPN可以作为肝癌侵袭转移治疗一个新的靶点。