论文部分内容阅读
目的:本研究观察二甲双胍对卵清蛋白（Ovalbumin,OVA）诱导的支气管哮喘小鼠水通道蛋白5（AQP5）和黏蛋白5AC（MUC5AC）表达以及粘液分泌的干预作用,并探讨其可能的机制。方法:选用BALB/c雌性小鼠,并按照随机数字法分为正常对照组（NS组）、哮喘模型组（AS组）、二甲双胍干预组（Met组）,共3组,每组各8只小鼠。将首次腹腔注射致敏时间规定为造模第1天,其中AS组及Met组于实验第1、8、15天给予OVA致敏液（包括OVA 50ug+氢氧化铝4mg）腹腔注射致敏,NS组则给予等量的生理盐水腹腔注射;于第22-28天AS组和Met组雾化吸入1%的OVA激发液激发,NS组则雾化吸入等量的生理盐水;且在雾化激发前半小时Met组给予二甲双胍（250mg/kg）溶液腹腔注射干预,AS组和NS组则给予等量的生理盐水腹腔注射,连续1周。末次激发完成12h后麻醉并处死各组小鼠,收取肺泡灌洗液（BALF）及肺组织标本。肺组织行石蜡切片,并采用苏木精-伊红染色法（HE）和过碘酸雪夫染色（PAS）观察其组织病理学变化;酶联免疫吸附试验法（ELISA）检测BALF中TNF-α和MUC5AC浓度;免疫组化观察小鼠肺组织中MUC5AC和AQP5蛋白的分布及表达情况;免疫印迹法（Western Blot）进一步测定肺组织AQP5的表达水平。结果:1.小鼠体重:NS组小鼠体重保持稳定,AS和Met组小鼠体重于第22-28d呈现下降趋势,但各组间比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。2.小鼠行为学表现:（1）致敏阶段:各组小鼠的外观、行为、反应、活动状况无明显变化（2）激发阶段:NS组小鼠在雾化开始时3min内可见活动增多,但随着雾化的持续逐渐适应并很快恢复正常,多次雾化后精神可,毛发仍光泽,活动自如;与NS组对比,AS组小鼠在雾化过程出现烦躁不安、抓耳挠腮和点头样呼吸,并逐渐加重,伴张口喘息和弓背直立等症状,以上不适均在雾化结束休息1h后缓解,多次雾化激发后可见小鼠毛发粗糙杂乱无光泽,且精神欠佳伴活动减少。与AS组不同,Met组抓耳挠腮、喘息等症状减轻,上述症状可在雾化激发后30min内缓解。3.肺组织病理:（1）HE染色:NS组气道结构完整,管腔通畅,气道内未见分泌物形成,肺组织内未见明显的炎症细胞浸润;AS组肺泡结构紊乱及部分破坏,气道管壁增厚、部分可见少许分泌物形成,伴管腔狭窄,气道壁和肺组织内可见以嗜酸性粒细胞为主的炎症细胞。与AS组比较,Met组气道结构相对完整,管壁略增厚,管腔未见明显狭窄及渗出,肺组织炎症细胞浸润有所减轻。（2）PAS染色:与NS组比较,AS组小鼠气道粘膜可见杯状细胞显著增生,伴粘液高分泌,两组间阳性染色面积百分比相比较差异有统计学意义（P＜0.05）;较AS组,Met组可见气道粘膜杯状细胞增生及粘液分泌明显减少,组间阳性染色面积百分比差异有统计学意义（P＜0.05）。4.BALF中的TNF-α和MUC5AC的浓度:AS组小鼠BALF中TNF-α、MUC5AC浓度均明显高于NS组,分别为200.49±6.63ng/L vs 111.09±8.25 ng/L、6.31±0.06μg/L vs 4.64±0.15μg/L,差异均有统计学意义（P＜0.05）;Met组小鼠BALF中的TNF-α、MUC5AC浓度分别为141.61±3.83ng/L和5.28±0.17μg/L,较AS组均显著降低,差异有统计学意义（P＜0.05）。5.肺组织AQP5和MUC5AC免疫组化结果:AS组与NS组相比较肺组织AQP5的表达下降,MUC5AC的表达升高,分别为0.236±0.003 vs 0.327±0.017、0.264±0.012 vs 0.175±0.011,Met组与AS组比较肺组织AQP5表达升高,MUC5AC的表达下降,分别为0.303±0.008 vs 0.236±0.003、0.203±0.012 vs0.264±0.012,差异均有统计学意义（P＜0.05）。6.AQP5的Western blot结果:AS组AQP5在肺组织中的表达量与NS组相比较明显下降,Met组中AQP5表达量较AS组显著升高,差异均有统计学意义（P＜0.05）。7.相关性分析:Pearson相关性分析结果表明,BALF中TNF-α浓度与肺组织AQP5表达水平与呈显著负相关（r=-0.9582,P＜0.0001）,与BALF中MUC5AC分泌水平呈显著正相关（r=0.9681,P＜0.0001）,与肺组织MUC5AC的表达水平呈显著正相关（r=0.9568,P＜0.0001）;BALF中的MUC5AC分泌水平与其在肺组织中的表达水平呈显著正相关（r=0.9439,P＜0.0001）;肺组织AQP5表达与BALF中的MUC5AC分泌水平呈显著负相关（r=-0.9328,P＜0.0001）,与肺组织MUC5AC的表达水平呈显著负相关（r=-0.9352,P＜0.0001）。结论:二甲双胍可改善支气管哮喘小鼠症状、气道炎症和杯状细胞增生,提高AQP5的蛋白表达水平,并减少MUC5AC在肺组织中的表达及BALF中的分泌,从而抑制哮喘小鼠气道的粘液高分泌,其减少MUC5AC的表达和分泌的过程可能是依赖于提高AQP5的表达量实现的。