枸杞多糖对四氯化碳诱导建鲤肝损伤的保护作用

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肝脏是鱼类的主要解毒器官,大部分外源及内源性物质在肝脏内进行代谢,因此极易受到多种肝毒物的损害。研究表明,许多化学物质可以导致鱼类的肝损伤。近年来,以肝胆体积及颜色异常为特征的"肝胆综合症"频被报道,这是一种非传染性疾病,发病率高,影响面积广,严重影响了水产养殖业的健康发展。目前还没有有效治疗该疾病的药物,因此,探寻防治鱼类肝胆疾病的有效药物具有非常重要的意义。本实验通过体外模型及在体模型,探讨枸杞多糖对四氯化碳诱导肝损伤的保护作用。主要研究内容及结果如下:1、精密肝切片厚度及培养基pH对肝切片活力的影响:设置切片的厚度(200 μm、300 μm、400 μm 及 500 μm)及培养基 pH(6.8、7.0 及 7.2),培养 0、8、16、24 及48小时后收集培养上清及切片。测定上清GOT、GPT和LDH活性和肝切片匀浆ATP含量。结果显示:切片厚度为300 μm,pH为7.0时,可在培养基中保持活力>16 h,综合上述实验结果,肝切片的制备及培养条件设定为:300 μm,pH 7.0。2、肝损伤模型的构建:用不同浓度的四氯化碳(4、8、12、16及32 mM)损伤肝切片(300 μm),4 h后,收集培养上清及切片。通过ATP含量检测肝切片活力,并检测培养上清GOT、GPT、AKP、LDH、SOD活性及MDA含量。Western blot测定肝切片核转录因子-κB(NF-κB)成员c-Rel和p65的蛋白表达量。实验结果显示,与空白组相比,16及32 mMCCl4处理的肝切片活力低,且培养上清中的MDA、GOT、GPT、LDH及AKP酶活力显著升高(P<0.05或P<0.01),SOD酶活性显著降低;4、8及12 mMCC14虽然也导致上述生化指标的变化,但是与空白组相比,切片活力变化不大。因此本试验用12 mMCCl4构建精密肝切片损伤模型。3、枸杞多糖对四氯化碳诱导肝损伤的保护作用:体外实验,用12 mMCC14诱导建鲤(Cyprinuscarpio)肝损伤。损伤前(前处理)、损伤后(后处理)、损伤前后(前后处理)分别用不同浓度的枸杞多糖(0.1、0.3和0.6 mg/mL)进行处理,收集培养上清及切片。检测培养上清GOT、GPT、LDH、SOD的活性及MDA含量,实时荧光定量 PCR(qRT-PCR)测定切片中 TNF-α、IL-1β、IL-6 及 iNOSmRNA 表达,ELISA法测定CYP1A、CYP3A、CYP2E1的酶含量变化,Western blot测定c-Rel和p65的蛋白表达。在体实验,将建鲤随机分为空白对照组,模型组,枸杞多糖药物对照组,处理组(枸杞多糖0.1%、0.5%、1.0%),连续饲喂60天后,模型组及处理组按体重0.05 mL/10g腹腔注射30%CCl4—植物油混合液,空白组及药物对照组注射植物油,72小时后收集肝脏及血清,检测GOT、GPT、LDH、SOD、MDA、GSH、T-AOC、GSH-PX及CAT等生化指标。结果显示,枸杞多糖可以显著提高切片活力及SOD活性,且有效地降低了 GOT、GPT、LDH活性和MDA含量;同时显著抑制CYP1A、CYP3A和CYP2E1的表达,对c-Rel和p65及其下游细胞因子的转录也起到了显著的抑制作用。其中,前处理组及前后处理组效果最佳,后处理组稍差,各组中0.3和0.6 mg/mL枸杞多糖的抑制效果较明显。在体实验中,0.5%及1%枸杞多糖浓度组对肝损伤有较显著作用。综合以上结果,枸杞多糖对建鲤化学性肝损伤有一定的保护作用。
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