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桔梗(Platycodon grandiflorum(Jacq.)A.DC)是多年生药食两用植物,具有排脓祛痰等功效,作为一种可药、食、赏兼用的传统中药,广泛应用在人们的生活中。对于桔梗人们的需求量有增无减,不少学者通过系统选育的方法培育出高产、高效、观赏性高的品种。本研究通过广泛搜集国内桔梗资源,研究它们的遗传背景,分析遗传多样性,解析群体遗传结构,为发掘优异野生桔梗种质,指导资源保存和进行品种选育提供科学依据。1、全长转录组测序以及SSR引物设计。本研究以2年生桔梗为材料,进行三代转录组测序,然后根据测序结果,设计SSR引物,用于桔梗遗传多样性和群体遗传结构分析。完成转录组测序后,共获得24.4Gb clean data的数据。获得ROI(reads of insert)695,772条,插入片段大小为1～6kb。获得全长非嵌合(FLNC,Full Length readsnon-chimeric)的序列477,700条,平均长度为2,081bp。全长序列中Artificial Concatemers比例为1.19%,全长序列占全部读取序列的比例是69.49%。使用SMRT Analysis软件的Iso Seq模块对全长序列进行聚类分析,共得到一致性转录本221,774个,平均长度为2,256bp。使用非全长序列校正后,获得高质量转录本序列147,884个,占全部转录本序列的66.68%。对高质量转录本以及校正后的转录本使用CD-HIT进行去冗余分析,将相似度高的序列合并后,得到75,440个转录本序列。基于转录组测序结果,共预测出76,642个SSR位点。经过筛选后,保留了5456个位点。根据这些位点,设计了74对SSR引物。2、从基于转录组测序开发的SSR引物中,筛选有效扩增引物。为了获得稳定可靠的扩增结果,本研究将转录组测序后开发的SSR引物进行了筛选,选择出扩增产物特异性强,杂带少,目标条带清晰可辨,并且在样本间有多态性的引物。首先,用9号(采样地为内蒙古自治区赤峰市茅荆坝三道沟)、13号(采样地为内蒙古自治区赤峰市左旗石棚沟林场)和18号(采样地为内蒙古自治区赤峰市高格斯台罕乌拉国家自然保护区)的桔梗样品为模板,对转录组测序后合成的引物进行第一轮筛选。由于样品量有限,用编号为24号(采样地为河南省修武市)、48号(采样地为河南省修武市)和69号(采样地为河南省信阳市鸡公山)的桔梗样品进行第二轮引物筛选。用聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳进行条带检测。保留扩增出清晰的目的条带的引物;扩增出模糊的目的条带的引物,根据其SSR位点重新设计合成引物,进行第二轮筛选;没有扩增出目的条带的引物筛除。最终,第一轮成功筛选保留了18对SSR引物,第二轮成功筛选保留了8对SSR引物。3、国内野生桔梗遗传多样性及遗传结构研究。采集内蒙古自治区、河南省、山东省、广西壮族自治区、重庆市和山西省等6个省份20个采样地的野生桔梗茎叶共计355份,硅胶干燥保存。利用试剂盒提取桔梗DNA。本研究最终采用了58对引物,对355个样品进行PCR扩增。58对引物包括文献报道的22对SSR引物和10对ISSR引物,利用1%的琼脂糖凝胶进行扩增产物的条带检测;另一部分引物是转录组测序后合成并经两轮筛选后保留的26对SSR引物,利用聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳进行条带检测。用Gen Al Ex 6.502软件、NTSYSpc Version 2.10软件等软件分析各样本之间的亲缘关系,解析群体的遗传多样性和遗传结构。将355份样本按照行政区划划分为9个群体,Gen Al Ex 6.502软件分析结果表明,遗传多样性的来源分为两部分,其中,24%的遗传差异来自于群体之间,76%的遗传差异来自于群体内部。所研究的355份桔梗中,总共产生了1206个差异条带位点。观察到的等位基因数目(No.of Different Alleles,Na)的平均值为0.743±0.010,有效等位基因数目(No.of effective alleles,Ne)的平均值为1.071±0.002,Shannon多样性指数(Shannon’s information index,I)的平均值为0.091±0.002,期望杂合度(Expected heterozygosity,He)的平均值为0.051±0.001。特异性条带(No.private bands=No.of bands unique to a single population)数目为3～137条,这些条带为该采样地样本所特有的条带。NTSYS软件对355份不同产地的桔梗DNA样品进行聚类分析,大致分为12大类。结果显示,355份样本没有按照采样地的区分,各自聚为一类,表明各省份的样本之间存在广泛的基因交流。这可能是人为引种、自然交配或其他原因造成了桔梗基因迁移。STRUCTURE软件对9个群体的355份样本进行群体遗传结构分析。结果表明,最佳K值为3(此时delta K值最大),表明将355份样本可以划分为3个亚群体,每个样本的血统分别用蓝色、紫色和橙色表示。其中,内蒙古自治区赤峰市大部分样本、河南省修武市少量样本和山东省威海市接近一半的样本,主要具有橙色血统。河南省修武市部分样本、河南省信阳市绝大部分样本、山东省青岛市绝大部分样本,主要具有蓝色血统。少部分山东省青岛市样本、重庆市城口县全部样本、山西省晋城市全部样本和部分山东省威海市样本,主要具有紫色血统。所研究的355份样本中,绝大部分样本的血统不纯,均杂合了其他血统。这一结果可以为桔梗资源的保护、品种选育以及开发利用提供科学依据。