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猪圆环病毒2型(PCV2)是猪皮炎与肾病综合征(PDNS)、断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)等猪病的主要病原。PCV2在世界范围内流行,给养猪业造成了巨大的经济损失。目前PCV2防控主要依靠疫苗免疫,上市的疫苗有全病毒灭活苗、重组嵌合苗和亚单位疫苗,其中制备全病毒灭活苗所用病毒滴度较低,制备成本较高;大肠杆菌和昆虫细胞/杆状病毒表达系统生产的亚单位疫苗工艺复杂、价格高昂,因此研制安全、高效的新型PCV2亚单位疫苗很有必要。自聚肽ELK16能在大肠杆菌内形成活性包涵体,其融合蛋白可用离心洗涤法纯化。结核杆菌热应激蛋白70(Hsp70)是重要的病原相关分子模式,通过Toll样受体2(TLR-2)刺激先天性免疫细胞,释放TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10和IL-12等细胞因子具有免疫佐剂作用。本研究以自聚肽ELK16为纯化标签,用于PCV2Cap蛋白和结核分枝杆菌Hsp70的融合表达和纯化,旨在简化PCV2亚单位疫苗和Hsp70分子佐剂的制备工艺。进而以小鼠为动物模型,评价分子佐剂对候选亚单位疫苗的免疫佐剂作用,为PCV2新型亚单位疫苗研制奠定基础。以自聚肽ELK16为纯化标签,分别与结核分枝杆菌Hsp70和PCV2 Cap基因融合,在重组大肠杆菌中进行诱导表达。在优化条件下,利用离心洗涤法进行融合蛋白纯化,获得了纯化的融合蛋白ELK16-Cap、ELK16-Hsp70和ELK16-Cap-Hsp70,其纯度高达95%、96%和85%,产量分别为92mg/L、84mg/L和83mg/L细菌培养。分别用ELK16-Cap、ELK16-Cap + 弗氏不完全佐剂(IFA)、ELK16-Cap + ELK16-Hsp70 和 ELK16-Cap-Hsp70免疫小鼠,设PBS对照组。初免后7、14、21和28天采血分离血清,用间接ELISA进行抗体检测,结果显示:在初免后7天,IFA + ELK16-Cap和ELK16-Hsp70 + ELK16-Cap免疫组即为ELISA抗体检测阳性,其他三组为特异抗体阴性;从初免后14天开始,四个免疫组的抗体水平呈逐渐上升趋势,其中ELK16-Hsp70 + ELK16-Cap免疫组抗体水平最高,IFA+ELK16-Cap免疫组次之,ELK.]6-Cap免疫组抗体水平最低;从初免后21天开始,四个免疫组的抗体水平进一步上升,ELK16-Cap-Hsp70免疫组抗体水平最高,ELK16-Hsp70+ELK16-Cap免疫组抗体水平次之,ELK16-Cap免疫组抗体水平最低。在二免后两周取免疫小鼠脾脏淋巴细胞,用试剂盒检测细胞因子表达。结果显示:PBS对照组、ELK16-Cap 免疫组、ELK16-Cap + IFA 免疫组、ELK16-Hsp70 + ELK16-Cap 免疫组和ELK16-Cap-Hsp70 免疫组的 TNF-α 浓度分别为 588.55、802.55、995.55、1382.55 和 1719.55 pg/mL,IFN-y 浓度分别为 46.30、92.22、155.56、470.37 和 518.15 pg/mL,IL-12 浓度分别为14.72、28.06、20.83、31.39和34.72 pg/mL。这些研究结果表明,分子Hsp70对刺激PCV2 Cap蛋白ELISA抗体产生的作用优于IFA,但两者融合蛋白的刺激作用较强;与Cap蛋白融合的Hsp70对刺激TNF-α、IFN-γ和IL-12产生的作用较强,而ELK16-Hsp70+ ELK16-Cap对三种细胞因子产生的刺激作用次之。为了优化PCV2重组抗原的抗原性,将His标签与PCV-2a、PCV-2d、PCV-2e中和表位和PCV-2b Cap基因进行融合表达,并将结核分枝杆菌Hsp70基因与4Cap-His进行融合表达,利用亲和层析法纯化得4Cap-His、Hsp70-His和4Cap-hsp70-His融合蛋白。将30只小鼠分为5组,分别为PBS对照组、4Cap-His免疫组、4Cap-His + Hsp70-His免疫组、4Cap-hsp70-His组和4Cap-His + IFA免疫组。初免后7和14天采血,用间接ELISA测定Cap蛋白特异抗体;在二免后14天取免疫小鼠脾淋巴细胞,用试剂盒测定细胞因子浓度。每组三只免疫小鼠用2x103 TCID50 PCV2b攻毒,第3和7天采血分离血清,用定量PCR检测病毒血症。结果显示:在初免后第七天,4Cap-His + Hsp70-His和4Cap-hsp70-His即为ELISA抗体检测阳性,其他三组为抗体检测阴性;初免后14天,对照组和4Cap-His免疫组仍为抗体检测阴性,4Cap-His + IFA免疫组为抗体检测阳性,但低于4Cap-hsp70-His免疫组;从初免后21天,四个免疫组的抗体水平明显上升,其中4Cap-hsp70-His免疫组的抗体水平最高。与对照组相比,四个免疫组的TNF-α、IFN-γ和IL-12表达水平明显上升,并高于刀豆蛋白A刺激组。与对照组相比,所有含4Cap重组蛋白的免疫组血清中病毒载量均呈降低趋势,攻毒后7天比3天明显下降,4Cap-hsp70-His免疫组病毒载量下降最多,4Cap-His + Hsp70-His免疫组次之,4Cap-His免疫组病毒载量下降最低。这些研究结果表明,ELK16标签对Hsp70刺激PCV2 Cap蛋白ELISA抗体产生无明显影响,两种方式融合Hsp70的体液免疫刺激作用优于IFA,均能刺激小鼠产生TNF-α IFN-γ和IL-12表达,并且Hsp70融合PCV2 Cap蛋白的刺激作用较强。