捕食性真菌作为寄生性线虫最重要的自然天敌,特别是Duddingtonia flagrans菌种有望成为新型的杀虫生物制剂将变得越来越让人期待。在评估其杀虫能力和临床应用潜力时,如何获得大量的生物制剂原材料-捕食性真菌厚壁孢子,了解它们的发育和生长特性,并进一步发掘D.flagrans捕食活性物质,非常值得人们深入持续地去进行研究和探索。为此,本论文了解了不同培养条件对捕食性真菌-D.flagrans生长的影响;对影响该真菌产孢量营养介质进行了筛选;对D.flagrans捕食线虫动态过程进行了详细观察;制备了捕食性真菌D.flagrans原生质体,并进行了标记和再生;对D.flagrans真菌的胞外蛋白酶的产生和生化性质进行了研究;并对胞外代谢酶进行了LTQ质谱检测和生物信息学分析;上述研究内容对掌握捕食性真菌-D.flagrans的生物学特性,了解其相关杀虫活性物质及其作用,探讨捕食机理具有重要意义。所取得的相关研究结果如下:(1)研究了不同温度、p H值及碳氮比例等培养条件对捕食性真菌-D.flagrans生长和发育的影响,结果表明,D.flagrans生长最适p H值范围为6.5~7.0,其中以p H 7.0中生长最快;最适温度为35℃;最适碳氮比范围为5:1~10:1,其中在碳氮比为5:1时,生长率最高。D.flagrans菌丝呈辐射状生长,纵横交错,无色,分隔,生长后期有缠绕圈和厚壁孢子的形成。(2)通过在捕食性真菌培养基中添加不同营养物质,观察了它们对D.flagrans厚壁孢子产生的影响;并以大麦粒和玉米粒作为培养基基质,对D.flagrans厚壁孢子的批量培养技术进行了研究比较。结果说明,在CMA培养基中,添加肌醇不仅能促进厚壁孢子的产生,还可以促进分生孢子的产生;在大麦粒为基质的培养基中,基质与水份比例为80:70的条件下,添加肌醇和吐温80后,产生的厚壁孢子数量最多,达2.35×106个/g;且大麦取材方便,操作简单,成本低廉,易于实际生产。该批量培养方法的建立,为开发D.flagrans临床生防制剂提供了重要科学依据。(3)利用CMA玻片培养基详尽观察了捕食性真菌-D.flagrans的生长发育以及其在捕食线虫动态过程中的形态学变化。结果显示,厚壁孢子在培养后第3d开始产生,第14d左右时完全发育成熟;而分生孢子则在第8d才开始出现。厚壁孢子和分生孢子的萌发率均在接种后第4d,即可达到90%以上。D.flagrans可以自发产生捕食器-菌环,且在培养基中最高达50个/cm2。线虫第三期幼虫在加入4h后即可以被捕食器捕获;24h后线虫即被完全致死;5d后,虫体发生皱缩直至完全消解。(4)通过研究酶浓度、酶解温度、菌龄、酶解时间对捕食性真菌-D.flagrans原生质体产生的影响,确定了D.flagrans原生质体最佳快速制备条件。试验得出,在溶壁酶2μL/m L、蜗牛酶8mg/m L、纤维素酶8mg/m L浓度时,35℃恒温条件下,酶解菌龄为2d的菌丝作用7h,D.flagrans产生的原生质体数量最多且能够再生。在此基础上,利用CFDA-SE对D.flagrans原生质体成功地进行标记,且标记后的原生质体再生后能够产生大量的分生孢子。这为下一步克隆捕食性相关基因或与其他真菌原生质体融合孕育新种奠定了重要基础。(5)利用添加有不同诱导物的枸椽酸培养基分别对捕食性真菌D.flagrans进行培养,收集产生的发酵液经过滤并用超滤管浓缩后,测定其中蛋白质含量、蛋白酶及磷酸酶活性,再用浓缩后的发酵液进行杀线虫和角蝇蝇蛆试验。研究发现,不同诱导物对D.flagrans代谢影响不同。在采用无菌马圆线虫(Strongylus)三期幼虫和氨基酸联合诱导的条件下,D.flagrans发酵液中蛋白质种类、浓度、蛋白酶比活性和磷酸酶活性及杀虫效力明显高于其他诱导组。同时,不同诱导物诱导产生的浓缩发酵液除了能杀灭线虫外,对蝇蛆也有一定毒杀作用。这一结果为捕食性真菌发酵液中高效杀虫毒力因子的提取和分离奠定了基础,也为致病性蝇蛆的生物防治提供了新的思路。(6)捕食性真菌-D.flagrans发酵液中胞外蛋白质经SDS-PAGE电泳和胶内酶解后,再经LTQ质谱技术鉴定,研究表明,加入诱导物不同,D.flagrans产生的蛋白质种类也不同,共检测出109种蛋白质。在氨基酸诱导组中,发现了烯醇化酶和酪氨酸磷酸化酶;在氨基酸和线虫幼虫联合诱导组中,检测到了丝氨酸蛋白酶;以上三种酶类均可能参与捕食性真菌侵染线虫的过程。进一步对所检测到的蛋白质进行生物信息学分析,GO功能注释表明,烯醇化酶和胞外磷酸酶均可参与多种物质的代谢过程,丝氨酸蛋白酶则有蛋白水解酶活性和内切酶活性。这三种酶的发现又一次验证了磷酸酶和蛋白酶在捕食性真菌侵染线虫过程中协同起作用的可能性,这为生防制剂的深入开发提供了新的研究方向。