叶酸是维生素B族的一员,能够为机体合成嘌呤和嘧啶提供碳原子,从而参与DNA和RNA合成、氨基酸代谢以及氧化反应。孕期叶酸缺乏是出生缺陷的一个重要危险因素。母亲在妊娠期前以及胎儿器官形成关键时期增补叶酸可有效降低胎儿神经管缺陷、唇腭裂和先天性心脏病等出生缺陷发生的危险性。目前关于叶酸缺乏导致胎儿出生缺陷发生的机理探索主要集中在胎儿自身发育的相关研究,从孕早期母体的角度探寻其具体发生机制的研究仍然较少,有待于进一步完善。课题组前期利用小鼠叶酸缺乏模型发现小鼠缺乏可导致胚胎着床后子宫内膜蜕膜层的血管发生和蜕膜细胞凋亡受到显著抑制。小鼠子宫内膜蜕膜化的正常进行对后期胎盘的形成和发育起着重要的调节作用。近年也有研究发现,叶酸缺乏可抑制胎盘绒毛滋养细胞的活性和侵袭能力、叶酸缺乏孕鼠胎盘组织基因组DNA甲基化显著下降,提示叶酸缺乏可能会影响胎盘发育,但其具体机制尚不明确。另有研究证实,叶酸缺乏可导致脑组织细胞发生自噬,提示自噬可能参与叶酸的代谢。自噬是生物体内一种相对保守的对物质进行分解代谢的过程,其主要通过清除细胞内有缺陷的大分子物质或衰老、损伤的细胞器等,维持胞内环境的稳定。研究发现自噬对于维持胎盘正常发育具有重要作用,同时也参与多种妊娠综合征的发生。因此,本研究旨在探讨叶酸缺乏对孕期胎盘发育影响的基础上,从自噬的角度进一步探寻其可能的作用机制。本课题的主要研究内容和结果如下:1.叶酸缺乏可导致孕鼠胎盘形态结构发生异常。为明确孕鼠叶酸缺乏与胎盘发育的关系,肉眼观察妊娠第10、12、14天孕鼠胚胎吸收率、子宫和胎盘外观,发现叶酸缺乏组(F10、F12、F14)孕鼠胚胎吸收率在妊娠第12和14天明显高于正常饮食组(N10、N12、N14)孕鼠;同时发现叶酸缺乏组孕鼠胎盘明显小于正常饮食组孕鼠胎盘。H&E染色结果显示,与N10、N12和N14组相比,F10、F12和F14组胎盘组织迷路层细胞轮廓不明显;F10和F12组中未观察到滋养层巨细胞;F12组海绵层和迷路区明显变薄,与底蜕膜有一定程度的分离。以上结果表明,孕期叶酸缺乏可引起小鼠胎盘结构发生异常。2.叶酸缺乏可导致孕鼠胎盘内分泌功能失调。ELISA结果显示F10和F12组小鼠血清Plgf、Pprh和CG水平分别明显低于N10和N12组;而F14组小鼠血清Plgf水平明显高于N14组;F10、F12组小鼠血清P4水平显著高于N10、N12组,而在D14天无显著差异。以上结果表明叶酸缺乏引发胎盘内分泌功能失调。3.叶酸缺乏能够抑制胎盘分化。IHC和Western blot结果显示,叶酸缺乏可导致血管发生相关因子Plgf和CD34在N10和N12中表达较F10和F12明显升高,而在N14中表达明显降低;胎盘分化相关因子Gcm1在正常饮食组各小鼠胎盘中的表达较叶酸缺乏饮食组明显升高。Real-time PCR结果显示:胎盘分化标志蛋白Gcm1、Hand1和Mash2在不同发育阶段的叶酸缺乏孕鼠胎盘中表达均显著降低。为了验证叶酸缺乏在人的胎盘组织中是否也具有损伤效应,收集人正常足月妊娠胎盘组织获取人胎盘外植体,用无叶酸培养基进行体外培养。IHC和Western blot结果表明,叶酸缺乏可导致人胎盘外植体的增殖分化相关蛋白(PCNA,Ki 67、PLGF、GCM1)的表达明显降低、凋亡相关蛋白(Caspase-3,Cleaved caspase-3)增加。同时采用无叶酸培养基培养人绒毛外滋养细胞系HTR8/SVneo细胞,流式细胞和Transwell实验证实该细胞凋亡和侵袭能力受到明显抑制。以上体内和体外实验结果表明,叶酸缺乏可抑制胎盘分化。4.叶酸缺乏可引起胎盘自噬紊乱。为了明确叶酸缺乏与自噬的关系,利用透射电镜分别检测妊娠10、12、14天小鼠胎盘和HTR8/SVneo细胞中自噬小体数量。结果显示,与正常组相比,F10组孕鼠胎盘自噬小体数量明显增多,而F12、F14组孕鼠胎盘自噬小体数量减少;HTR8/SVneo细胞经无叶酸培养基培养后,细胞中自噬小体明显增多。采用IF、Western Blot及Real-time PCR技术分析发现:与正常组相比,F10组孕鼠胎盘中,自噬相关蛋白LC3、Atg5、P62的表达显著增加,而F12和F14组显著下降;人胎盘外植体和HTR8/SVneo细胞经无叶酸培养基培养后自噬相关蛋白的表达显著增加。Mrfp-Egfp-LC3质粒转染也表明叶酸缺乏组HTR8/SVneo细胞自噬明显增强。以上结果表明,叶酸缺乏能够导致胎盘发育过程中的自噬紊乱。5.自噬参与调控由叶酸缺乏引起的胎盘异常发育过程。为了深入探讨叶酸缺乏引起胎盘发育异常的机制,利用自噬抑制剂3-MA分别抑制妊娠第10天孕鼠胎盘、人胎盘外植体和HTR8/SVneo细胞的自噬水平。孕鼠经自噬抑制剂3-MA处理后,与单独叶酸缺乏组相比较,自噬抑制剂3-MA联合叶酸缺乏处理后胚胎再吸收率显著降低、原本受损的胎盘体积和外观形态得到一定程度的恢复、胎盘分化和血管发育标志分子Gcm1、Plgf、Hand1、Mash2的表达也呈现出一定程度的逆转。人胎盘外植体经叶酸缺乏培养基和自噬抑制剂3-MA联合培养后,Caspase-3,Cleaved caspase-3,PCNA,Ki67、GCM1和PLGF表达明显回升。HTR8/SVneo细胞经叶酸缺乏培养基和自噬抑制剂3-MA联合培养后,细胞侵袭能力和凋亡明显恢复。以上体内和体外实验结果均表明自噬能够调控由叶酸缺乏引起的胎盘异常发育。综上所述,本研究在课题组前期工作的基础上进一步探讨叶酸缺乏对胎盘发育的影响。采用动物模型并结合人胎盘外植体组织和人胎盘绒毛外滋养细胞HTR8/SVneo体外培养实验研究发现:孕期叶酸缺乏可诱发胎盘充血栓塞,胎盘形态结构异常,内分泌功能失调,正常分化受阻,进而导致胎盘发育异常。这种胎盘发育缺陷和细胞自噬调控紊乱密切相关。我们的研究为充分认识和了解母体叶酸缺乏导致胎儿出生缺陷的发生机制提供了新的实验依据。