牛至（Origanum vulgare）是一种具有抗菌、抗氧化和抗诱变等多种生物活性功能的唇形科牛至属植物,含有挥发油、多酚和黄酮等多种次生代谢物。迷迭香酸（RosA）是一种天然酚酸类化合物,也是牛至中的标志性次生代谢产物。植物细胞培养因具有周期短、稳定性高、目标物提取和纯化容易等优点,有望用于RosA的生产。本实验室前期筛选培育出了生长状态良好的牛至愈伤系,并建立了稳定的细胞悬浮培养体系,从中鉴定得到迷迭香酸-3-O-葡糖苷、RosA和迷迭香酸甲酯等六个多酚类化合物。为了进一步提高牛至细胞中RosA的产量,本文研究了激素对牛至悬浮培养细胞生长和RosA合成的影响,进行了激素的筛选与优化,通过转录组和代谢组联合解析了激素促进RosA合成的机制,同时对WRKY70、WRKY75显著差异表达基因的结构及特征进行生物学信息分析,采用同源重组技术构建了超表达载体,并通过瞬时表达验证了WRKY70的功能。主要结果与结论如下:（1）激素对牛至悬浮培养细胞生长的影响及其筛选和优化:本文采用1+1模式（细胞分裂素+生长素）进行6-糠基氨基嘌呤（KT）、6-苄氨基嘌呤（6-BA）、玉米素（ZT）、噻苯隆（TDZ）、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）、萘乙酸（NAA）和吲哚丁酸（IBA）7种激素对悬浮培养细胞生长的影响及筛选试验,结果表明:细胞分裂素以0.5～2.0 mg/L 6-BA效果最好,生长素以4.0 mg/L NAA效果最好。采用全面试验设计对6-BA和NAA激素组合的浓度进行优化,结果表明激素配比为0.5 mg/L 6-BA和4.0 mg/L NAA时,细胞生物量最高可达到20.25 g/L。（2）激素对牛至悬浮培养细胞RosA合成的影响及其筛选和优化:本文在上述生长激素筛选和优化组合试验基础上,采用2+1模式（“2”即0.5 mg/L 6-BA+4.0mg/L NAA;“1”即在生长所需激素基础上所加的另一种激素）进行KT、ZT、TDZ、2,4-D、IBA、赤霉素（GA3）、脱落酸（ABA）、乙烯利（ETH）、茉莉酸甲酯（Me JA）和精胺（Spm）10种激素对细胞RosA合成的影响及筛选试验,结果表明:ZT、2,4-D、GA3对细胞的生长和RosA合成均产生抑制作用;KT、TDZ、IBA、ETH及Me JA对细胞生长没有影响,但抑制RosA合成;ABA、Spm促进细胞生长和RosA积累,其中0.3 mg/L ABA作用下RosA含量和产量为12.14 mg/g和285.98mg/L,是对照组的3.06倍和3.10倍;对ABA的添加时间进行优化试验,确定第0天为ABA的最佳添加时间,细胞RosA含量和产量分别为12.99 mg/g和283.54 mg/L,是对照组的3.18倍和3.47倍。（3）ABA作用下牛至悬浮培养细胞的转录组测序和分析:基因差异表达分析结果发现,ABA处理组和对照组（未添加ABA）之间共有785个差异表达基因（DEGs）,显著上调的基因有430个,显著下调的基因有355个。通路富集分析结果表明,共12个DEGs参与到ABA生物合成及信号转导途径,其中ZEP1、ABA2、PYL4、PP2C等基因表达上调;在RosA合成相关途径中共注释到11个DEGs,其中HPPR（TRINITY＿DN36914＿c0＿g1）变化最显著,表达量上调了4.18倍;此外,共9个转录因子与ABA信号转导和苯丙烷合成相关,其中WRKY70、MYB61、ERF110等7个转录因子表达量上调。同时,本文采用RT-q PCR验证了4CL、HPPR、CYP等9个与RosA生物合成和调控相关的基因表达情况与转录组测序所得的数据基本一致。（4）ABA作用下牛至悬浮培养细胞代谢组检测和分析:在正、负离子模式下分别鉴定了733和524种物质。通过PCA和OPLS-DA分析方法研究两组样品间的代谢物差异,表明ABA调控作用效果明显。KEGG富集分析结果表明,共有233种差异代谢物富集到86条代谢通路中,其中与RosA代谢相关的通路涉及:苯丙素生物合成途径、苯丙氨酸代谢途径、酪氨酸代谢途径、植物激素信号转导途径。RosA合成途径上的L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、肉桂酸、对香豆酸、4-羟基苯丙酮酸和RosA的含量均有了不同程度的增加。（5）转录组和代谢组联合解析ABA调控RosA合成的机制:通过转录组和代谢组的检测结果同时向KEGG通路进行映射,共获得16个差异代谢物和37个相关转录本。差异表达分析结果表明,与RosA合成途径相关的共有6种代谢物和11个相关转录本调控差异显著,其中,对香豆酸、4-羟基苯丙酮酸、RosA等4种代谢物的含量及其相关转录本的表达呈现同增的趋势。通过上述结果分析,可以推测ABA调控下的牛至悬浮细胞RosA的合成主要是激活了L-苯丙氨酸和L-酪氨酸两条代谢通路,在这两个分支途径中,由于4CL、HPPR、RAS等基因表达量的上调引起其下游的代谢物的含量增加,从而促进牛至悬浮培养细胞中RosA的积累。（6）牛至差异表达基因的克隆与功能验证:采用RT-PCR和同源克隆技术从牛至中克隆获得WRKY70、WRKY75基因的全长c DNA序列,并利用同源重组技术构建了牛至WRKY70、WRKY75超表达载体,通过测序验证正确性。WRKY70、WRKY75蛋白均属于不稳定的亲水蛋白,没有信号肽和剪切位点,无需跨膜转运,可能在细胞核中发挥其生物学功能,主要由无规则卷曲组成。通过瞬时表达技术验证了WRKY70基因的功能。HPLC结果表明,WRKY70瞬时超表组的牛至叶片RosA含量是对照组的2.76倍。上述结果说明,WRKY70基因的上调能够显著促进RosA的合成。综上所述,ABA能显著提高牛至悬浮培养细胞中RosA的产量,优化条件下产量为对照组的3.47倍;转录组和代谢组联合检测与分析的结果表明,ABA促进了WRKY70、MYB61、ERF110等调控基因的表达,进而使4CL、HPPR、CYP等结构基因表达量的上调,最终导致了RosA的合成;WRKY70和WRKY75是RosA合成相关的两个显著上调表达的调节基因,瞬时超表试验表明WRKY70基因的上调能够显著促进RosA的合成。本研究为牛至细胞悬浮培养生产RosA的调控提供了理论依据。