目的:目前,诸多研究报道了以半乳糖、叶酸、转铁蛋白、乳铁蛋白等为靶头的配体脂质体,制备得到的配体脂质体与不含配体的脂质体相比,对癌细胞具有显著的靶向作用。其中,研究最多的是以半乳糖基为靶头的配体脂质体。末端为半乳糖基的配体脂质体能被去唾液酸糖蛋白受体(Asialoglycoprotein receptor,ASGPR)所特异性识别,随后脂质体会被内吞至细胞内,这种内吞作用具有高效性和特异性。ASGPR大量并单一表达于肝癌细胞表面,因此,以半乳糖基为靶头的配体脂质体可作为抗癌药物肝靶向治疗的理想载体,其可提高肝癌细胞对药物的摄取。然而,目前研究针对ASGPR所构建的半乳糖配体脂质体在血浆中稳定性不高,被包载药物容易从脂质体中渗漏,导致药物突释,药效降低。研究表明,若采用亲水性的聚乙二醇(Polyethyleneglycol,PEG)对脂质体进行表面修饰,脂质体的表面可形成亲水性保护层,其能有效降低脂质体与血浆蛋白的互相作用,屏蔽了网状内皮系统(Reticuloendothelial system,RES)对脂质体的识别,增加脂质体在血浆内的稳定性,延长脂质体在生物体内的滞留时间。同时,PEG修饰的脂质体可通过实体瘤的高通透性和滞留效应(Enhanced permeability and retention effect,EPR effect)到达癌细胞周围,进一步增加了癌细胞对药物摄取的可能。多西他赛(Docetaxel,DOC)是以欧洲红豆杉树皮或针叶中的提取物10-脱乙酰基巴卡丁III为母核,经半合成方法合成的广谱细胞毒性抗癌药。体外研究表明,DOC具有很好的抗肝癌活性,它可以诱导肝癌细胞凋亡,使细胞周期停留在G2/M期。然而DOC在体内的治疗效果仍然不佳,在晚期肝癌患者的II期临床试验中,DOC没有表现出足够的有效性和安全性。原因是DOC在体内没有肝癌细胞靶向性,能达到肝癌细胞的DOC有限。基于上述背景,本研究以DOC为模型药物,构建一种同时接载了长循环材料"二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)"和肝靶向配体分子"胆固醇半乳糖苷(Chol-Gal)"的脂质体(CG-SSL-DOC),目的是:第一,增加脂质体在血浆中的稳定性,避免被包载药物的突释,延长脂质体在体内的滞留时间。第二,通过肝癌细胞表面的ASGPR介导的内吞作用,提高肝癌细胞对DOC的摄取,实现DOC对肝癌细胞的靶向传递,从而增强DOC治肝癌的疗效,降低用药剂量。方法:1.多西他赛长循环脂质体(SSL-DOC)的药学研究(1)对SSL-DOC进行处方前的研究,包括脂质体中DOC含量测定方法的建立和DOC油水分配系数的测定。采用HPLC法测定DOC含量;采用摇瓶法和水-正辛醇系统测定DOC的油水分配系数。(2)对SSL-DOC的处方和制备工艺进行优化研究。以包封率为指标比较了两种脂质体的制备方法;通过单因素试验研究各因素对脂质体包封率的影响;利用正交设计进一步优化脂质体的处方。(3)对SSL-DOC进行冷冻干燥研究。利用冷冻干燥法制备SSL-DOC;利用单因素试验研究冻干过程中各关键因素对脂质体包封率和粒径的影响。(4)利用薄膜分散法结合冻干工艺制备了 SSL-DOC,并对其药剂学性质进行评价。肉眼观察脂质体外观;采用透射电镜观察脂质体的形态;采用葡聚糖凝胶法测定脂质体的包封率;利用粒度仪测定脂质体的粒径和zeta电位;体外透析法测定脂质体的释放度;TBA-反应法测定脂质体的氧化产物值。(5)对SSL-DOC进行稳定性研究,包括影响因素试验、加速试验、长期稳定性试验和配伍稳定性试验。影响因素试验:将SSL-DOC置于高温(40℃)、高湿(RSH75%±5%)和强光(45001x±5001x)条件下10天,考察脂质体各药剂学性质的变化情况。加速试验:SSL-DOC置于25℃±2℃,RH600%±10%条件下6个月,考察脂质体各药剂学性质的变化。长期试验:SSL-DOC置于4℃条件下12个月,考察脂质体各药剂学性质的变化。配伍稳定性试验:SSL-DOC与21种常用输液剂进行配伍,室温(25℃)放置24h,考察脂质体各药剂学性质的变化。2.Chol-Gal的酶促合成、结构表征,CG-SSL-DOC的构建与药剂学性质评价(1)采用酶促法合成Chol-Gal分子,利用MS、NMR等技术分析鉴定产物的结构特征。(2)利用薄膜分散法结合冻干工艺制备了 CG-SSL-DOC,并对其药剂学性质进行评价。肉眼观察脂质体外观;采用透射电镜观察脂质体的形态;采用SephadexG-50法测定脂质体的包封率;利用粒度仪测定脂质体的粒径和zeta电位;体外透析法测定脂质体的释放度;TBA-反应法测定脂质体的氧化产物值。3.脂质体的安全性研究、抗肝癌作用及机制研究和药代动力学研究(1)按照药典方法对SSL-DOC和CG-SSL-DOC进行热原和溶血检查,以多西他赛注射液(Docetaxel,inJection,DOC-I)为参照制剂;以KM小鼠为动物模型,采用半数致死量法考察SSL-DOC和CG-SSL-DOC的体内毒性情况,采用SPSS软件计算LD50值,通过比较各组DOC制剂LD50值大小,评价其体内毒性。(2)以HepG2细胞、A549细胞和Heal细胞为细胞模型,采用MTT法考察各DOC制剂对癌细胞的增殖抑制作用,通过比较各DOC制剂的IC50值评价其体外抗癌效果;采用香豆素-6(Coumarin-6)作为荧光指示剂,制备Coumarin-6长循环脂质体(SSL-Coumarin-6)和 Chol-Gal 修饰的 SSL-Coumarin-6(CG-SSL-Coumarin-6),分别利用荧光酶标仪和荧光显微镜定量定性分析细胞与脂质体的结合率。(3)以新西兰兔为动物模型,考察SSL-DOC和CG-SSL-DOC体内药代动力学规律,DOC-I作为参照制剂。以紫杉醇(Paclitaxel,PTX)作为内标物,甲基叔丁基醚为萃取溶剂,LC-MS/MS测定血浆中DOC的含量。通过DAS 2.0软件分析各组DOC制剂的药代动力学参数,评价其药代动力学特征。成果:1.SSL-DOC的药学研究(1)首先建立了脂质体中DOC含量的HPLC测定方法,结果显示,该方法稳定可行。其次测定了 DOC的油水分配系数,结果显示,DOC的油水分配系数lgP值为3.17±0.32,属于脂溶性较强药物。(2)通过比较,本研究选择了适用于脂溶性药物的薄膜分散法制备脂质体,通过对孵育温度和探头超声时间的筛选,得出最佳的孵育温度为50℃,最适宜的探头超声时间为10min。通过单因素试验研究发现,EPCS与CHO-HP质量比、药脂比和DSPE-PEG2000的加入量对脂质体的包封率具有显著的影响。在此基础上,本研究采用了正交设计法进一步优化脂质体处方,得出SSL-DOC的最佳处方为:EPCS与CHO-HP 的质量比为 3:1(w/w),药脂比为 1:15(w/w),DSPE-PEG2000 的量为 2%(mol%)。(3)通过对SSL-DOC的冷冻干燥研究发现,最佳的冻干保护剂种类是蔗糖和甘露醇合用,两种糖的比例为1:1(w/w),总糖加入量为膜材的8倍(w/w),采用外加法加入效果最佳。而最佳的冻干工艺是:采用速冻方式置于-80℃预冻2h。得到SSL-DOC外观饱满、表面平整,包封率及粒径与冻干前相比没有明显差别。(4)SSL-DOC的药剂学性质结果显示,SSL-DOC外观饱满、表面平整;电镜下观察呈类圆形,粒径在100-200nm之间;采用SephadexG-50法测定脂质体包封率稳定可行,SSL-DOC的包封率为92.70±2.05%,载药量大于5%,粒径为156.70±2.26 nm,PDI为0.14±0.01,Zeta电位为-21.70±3.57mV,氧化产物值和pH值检查均符合要求。(5)影响因素试验结果显示,高温和强光条件放置10天后会造成SSL-DOC渗漏率和粒径增大,氧化产物增多。而高湿条件放置10天后会引起SSL-DOC复溶时间延长,渗漏率增大。加速试验结果显示,SSL-DOC的外观、复溶时间、zeta电位、pH值和氧化产物值没有明显变化,但存在渗漏率和粒径增大的情况。长期试验结果显示,SSL-DOC放置9个月后各项指标变化不大,但12个月后开始出现异常。配伍稳定性试验结果显示,除乳酸林格注射液等7种输液剂外,SSL-DOC与其他14种输液剂配伍后各项指标未见异常情况。2.Chol-Gal的酶促合成、结构表征,CG-SSL-DOC的构建与药剂学性质评价(1)Chol-Gal的产率和纯度均在95%以上,通过MS、1H-NMR、13C-NMR方法确证了产物的结构特征。(2)CG-SSL-DOC的药剂学性质结果显示,CG-SSL-DOC外观饱满、表面平整;电镜下观察呈类圆形,粒径在100-200nm之间;CG-SSL-DOC的包封率为92.54±2.74%,载药量大于 5%,粒径为 157.47±1.37nm,PDI 为 0.18±0.01,Zeta 电位为-23.90±4.93 mV,氧化产物值和pH值检查均符合要求。体外释放研究表明,透析法可用于测定脂质体体外释放度,选用含0.5%Tween-80的PBS 7.4作为释放介质。CG-SSL-DOC具有缓慢释药特征,释药规律与Higuchi模型相似。3.脂质体的安全性研究、抗肝癌作用及机制研究和药代动力学研究(1)溶血检查结果显示,SSL-DOC和CG-SSL-DOC均不会产生溶血现象,而DOC-I可见溶血现象;3组DOC制剂均不会导致热原现象。急性毒性试验结果显示,SSL-DOC和CG-SSL-DOC的LD50分别为DOC-I的1.63和1.66倍,体内安全性较DOC-I有所提高。(2)MTT 试验结果表明,与 SSL-DOC 和 DOC-I 相比,CG-SSL-DOC 对 HepG2细胞的增殖抑制作用分别提高了 3.80倍和9.06倍,但3组DOC制剂对A549细胞和Hela细胞的抑制效果差别不大。细胞摄取试验结果显示,HepG2细胞对CG-SSL-Coumarin-6 的摄取量是 SSL-Coumarin-6 的 1.77 倍,Chol-Gal 提高了 HepG2细胞对脂质体的摄取,这是依赖于HepG2细胞表面的ASGPR介导的内吞作用。(3)在新西兰兔体内药代动力学研究试验中,首先建立了 DOC兔体内血药浓度LC-MS/MS的测定方法,结果表明该方法稳定可行。药代动力学参数的分析结果表明,两组长循环脂质体制剂的体内半衰期和AUC要大于DOC-I组,且清除率显著下降。此外,CG-SSL-DOC的半衰期小于SSL-DOC,而清除率有所增加,提示这种现象可能与CG-SSL-DOC靶向至肝细胞有关。结论:综上所述,本研究所构建的CG-SSL-DOC包封率高,粒径分布均匀,在体外具有缓释作用和良好的稳定性。通过药代动力学研究证明,CG-SSL-DOC在体内释放缓慢,具有长循环效应。同时,通过体外抗肝癌研究证明,CG-SSL-DOC可通过ASGPR介导的内吞作用,显著提高肝癌细胞对DOC的摄取,从而提高了 DOC对肝癌细胞的增殖抑制作用。我们有理由相信,CG-SSL-DOC在未来有望成为肝癌靶向治疗的新型制剂。