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目的1、研究HBV对HepG2细胞的自然感染及在HepG2细胞中的复制与核心抗原表达2、构建带有HBV调控序列的核心区基因真核表达载体3、研究HBV核心区基因在HepG2细胞中的表达及其上游调控序列对核心区基因的调控4、研究HBV DR区整合方法1、用HBV DNA荧光定量1.5×1010copies/ml的大三阳血清自然感染HepG2细胞,ELISA检测HBeAg,免疫组化检测HBcAg, PCR检测HBV cccDNA, RT-PCR检测HBc mRNA。2、重组PCR扩增带有上游调控序列的HBV核心区基因,双酶切,T4连接酶连接重组体,将该区基因克隆入破坏了CMV启动子的pcDNA3.1(+)载体,构建pcDNA3.1(+)-HBV X-C真核表达载体。3、用LipofectamineTM2000将pcDNA3.1(+)-HBV X-C真核表达载体转染HepG2细胞,G418筛选阳性细胞株,免疫组化检测HBcAg, HBxAg, ELISA检测HBeAg, RT-PCR检测HBx mRNA及HBc mRNA。4、从整合有HBV X-C基因的HepG2细胞中提取总DNA, PCR扩增X-C片段、X基因片段及C基因片段。结果1、感染12h后,ELISA检测到细胞培养上清中HBeAg,以后迅速下降,免疫组化未检测到HepG2细胞中存在HBcAg, RT-PCR未检测到HBc mRNA,跨双缺口引物也一直未检测到HBV cccDNA.2、建立了重组PCR扩增跨双缺口HBV X-C基因序列的方法,成功构建了pcDNA3.1(+)-HBV X-C真核表达载体。3、重组pcDNA3.1(+)-HBV X-C真核表达载体可在HepG2细胞中表达出HBcAg,但ELISA未检测出HBeAg。4、经筛选后的阳性细胞株中,PCR只能检测出X基因片段及C基因片段,但一直未扩增出X-C整段DNA。结论1、使用HBV大三阳血清中的病毒是否可以感染HepG2细胞还需进一步研究。2、建立了重组PCR扩增跨双缺口HBV X-C DNA序列的方法,成功构建了pcDNA3.1(+)-HBV X-C真核表达载体,为以后对HBV核心区基因表达调控的研究奠定基础。3、HBV核心区基因在其自身上游调控序列的调控下,在HepG2细胞内可成功启动其表达,但HBeAg的分泌除了受到基因调控因素的影响外,可能还受到其他一些因素的影响。4、X基因和C基因分别整合入HepG2细胞基因组,但是X-C DNA片段未能完整整合入HepG2细胞基因组,可能HBV DR还保留有复制及整合功能。