辅酶Q10广泛存在于生物细胞内,是呼吸链中的电子传递体,其结构由醌环和聚异戊二烯侧链组成。辅酶Q10具有增强呼吸链,加大能量供给的作用,被广泛应用于各种疾病的治疗和预防,如:心脏病、高血压和帕金森等。除此之外,由于辅酶Q10还具有良好的抗氧化能力,所以在食品和化妆品市场的需求量也与日俱增。本文对影响类球红细菌合成辅酶Q10的相关因素进行分析,并在此基础上对其生物合成途径进行综合代谢调控以构建辅酶Q10高产菌株。目前关于辅酶Q10工程菌的构建思路主要集中于对其生物合成途径基因的过表达。虽然这些调控策略取得了很好的效果,但在代谢网络中还有很多其他途径会对辅酶Q10的积累产生影响。如,能够和辅酶Q10竞争前体物醌环和萜类物质的代谢途径;与呼吸链功能相关的代谢途径等等。在本研究中,主要对这些非辅酶Q10合成途径进行调控,然后将其与辅酶Q10合成途径相结合进行综合调控。在类球红细菌中,类胡萝卜素缺失会对细胞生长造成非常不利的影响。但是类胡萝卜素又与辅酶Q10合成途径竞争前体物质香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)。为了减少类胡萝卜素途径对GGPP的竞争,同时维持类球红细菌细胞的正常生长,本研究通过过表达光氧调控因子ppsR抑制crt系列基因的表达强度,使类胡萝卜素的合成受到适度抑制,从而使辅酶Q10的产量提高了 28%左右。由于PpsR对光合基因具有普遍的抑制作用,GGPP合成关键酶crtE的表达强度也被抑制到只有野生型的一半。本研究将crtE和ppsR串联用tac启动子表达,从而解除了PpsR对crtE表达的抑制,达到了进一步提高辅酶Q10产量的目的。最终辅酶Q10的产量达到73.2mg/L,比野生型提高了 47%。作为细胞呼吸链的递氢体,辅酶Q10的主要功能是将NADH上的电子转移到呼吸链。所以辅酶Q10的功能与胞内NADH/NAD+比例有着紧密的联系。在本研究中,通过过表达gapA-1使RspgapA中NADH/NAD+比例较对照组提高了 2倍,同时辅酶Q10的产量也提高了 29%。这一现象证明了类球红细菌胞内的NADH/NAD+比值与辅酶Q10的积累存在着正相关的关系。但是在这一过程中RspgapA的生物量却下降了。为了提高类球红细菌的生物量,本研究在类球红细菌中表达了外源的vgb基因来提高菌体的摄氧率,通过协同调控氧化还原电位和摄氧率来进一步提高辅酶Q10的产量。最终RspGV的辅酶Q10产量达到了 83.24 mg/L,与野生型相比提高了 71%。对gapA-1的两个同工酶gapB2和gapB3分别进行过表达也提高了 NADH/NAD+比例,同时增强了类球红细菌辅酶Q10的合成能力。该现象进一步确认了加强甘油醛-3-磷酸脱氢酶的表达可以提高NADH/NAD+比例,进而提高辅酶Q10的产量。结合上述两种调控策略,对类胡萝卜素合成途径和氧化还原电势及摄氧率进行协同调控,构建了 RspPEGV菌株。该菌株的类胡萝卜素合成途径被显著地抑制,但是由于生物量出现大幅的下滑,导致最终的辅酶Q10产量只有62.71 mg/L,低于单独调控时的产量。由于两个非辅酶Ql0合成途径结合调控的效果不理想,所以将上述两个非辅酶Q10合成途径分别结合辅酶Q10合成途径进行综合调控。首先协同调控类胡萝卜素合成途径和辅酶Q10合成途径,构建RspMQPE菌株。该菌株的类胡萝卜素合成途径同样受到显著的抑制。虽然辅酶Q10的产率高于单独调控类胡萝卜素的策略,但是仍然低于RspMQd菌株(综合调整MEP途径和醌环修饰途径的类球红细菌,本实验室构建),最终的辅酶Q10产量并没有得到提高。然后协同调控氧化还原电势及摄氧率和辅酶Q10合成途径,构建了 RspMQGV菌株。RspMQGV的生物量和NADH/NAD+比例与RspMQd相比都得到了提高。最终RspMQGV的辅酶Q10产量比RspMQd提高了19%,与野生型相比提高了 2.36倍。本研究还考察了供氧条件对辅酶Q10合成的影响,发现在发酵前期充分供氧,发酵中后期适当限制氧供给有利于辅酶Q10的积累。最后通过高密度发酵实验进一步考察RspMQGV菌株的辅酶Q10生产水平。经过96h的发酵,辅酶Q10的产量达到600 mg/L,为目前报道的以类球红细菌工程菌生产辅酶Q10的最高产量。