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研究背景和目的:近几年来,我国恶性肿瘤的发病率和死亡率均呈持续升高趋势。结肠癌作为消化道肿瘤中的常见类型,其发病率和死亡率均位居恶性肿瘤的前十位。结肠癌的发生具有性别、地域和人种的差异,其中男性发病率高于女性,北美、西欧地区发病率高于非洲及亚洲地区,非洲裔美国人发病率高于同地区白种人[1-3]。Ascl2(Achaete scute-like2)转录因子是Wnt信号的靶作用因子之一,可以参与控制肠道隐窝干细胞和结直肠肿瘤前体细胞的命运。我们前期研究发现,结直肠肿瘤细胞中敲除Ascl2基因会促进肿瘤细胞向杯状细胞表型分化,同时出现杯状细胞特异性标志物MUC2,TFF3和CDX2。尾型同源异型框转录因子2(CDX2,caudal-related homeodomain transcription factor 2)是新发现的一种核转录因子,特异性的表达于消化道上皮细胞中。具有参与控制胚胎细胞的分化和发育,维持成体肠道细胞稳定性的作用。CDX2与胃肠道肿瘤的发生密切相关,其异常表达可以诱导胃及食管粘膜上皮细胞发生肠上皮化生。同时,CDX2可以作为肿瘤抑制因子,抑制肠道肿瘤细胞的扩散和迁移。到目前为止,CDX2基因通过何种机制抑制肠道肿瘤发生还不是很清楚。本研究通过冷泉港数据库和NCBI数据库分析CDX2近端启动子,发现该区域存在丰富的E-box元件。本课题组前期研究证实,Ascl2的表达抑制可导致结肠上皮细胞出现杯状细胞表型转变,Ascl1,可以特异性的结合于E-box元件,那么Ascl2作为Ascl1的同源基因,也可能通过以此方式调控CDX2基因的表达[4-5]。本研究通过在敲除Ascl2基因的结直肠肿瘤细胞中转染CDX2启动子片段,采用双荧光素酶活性实验和染色质免疫共沉淀(Ch IP)技术进行检测,探讨人结肠癌上皮细胞中Ascl2转录调控CDX2基因表达的作用机制。方法:1.以人结肠癌细胞株LS174T基因组DNA为模板,PCR扩增人CDX2近端启动子(-2000~1)区域。2.应用冷泉港数据库和TF Search数据库预测分析CDX2启动子区域的潜在结合位点;3.根据E-box元件在CDX2启动子区域中的位置,确定CDX2启动子缺失片段的各个扩增区域,以CDX2近端启动子(-2000~1)区域DNA为模板,PCR扩增出相应DNA片段;4.构建CDX2启动子及缺失片段荧光素酶报告基因质粒并经过测序鉴定;5.将重组质粒转染到sh RNA-Ctr/LS174T和sh RNA-Ascl2/LS17T细胞中,并检测其双荧光素酶转录活性;6.染色质免疫共沉淀实验检测转录因子Ascl2与CDX2启动子的结合情况;结果:1.成功PCR扩增出CDX2近端启动子(-2000~1)区域;2.经TF Search 1.3和冷泉港数据库对CDX2启动子区域分析发现该区域含有8个E-box元件,同时还含有多个潜在转录因子结合的保守序列;3.成功PCR扩增出CDX2启动子的各缺失片段;4.成功构建荧光素酶报告基因表达载体p GL3-CDX2-C1及7个CDX2缺失片段的荧光素酶报告基因表达载体p GL3-CDX2-C2~C8,经双酶切及测序证实插入片段序列正确;5.双荧光素酶报告基因检测系统检测p GL3-CDX2-C1~C8在sh RNA-Ctr/LS174T和sh RNA-Ascl2/LS17T细胞中的双荧光素酶活性,结果表明重组质粒在sh RNA-Ctr/LS174T细胞中的荧光素酶活性明显低于sh RNA-Ascl2/LS17T细胞(P<0.01),相对荧光素酶活性随着CDX2启动子插入片段的不断缩短呈升高趋势;6.Ch IP实验证实Ascl2可能与CDX2启动子区域的某些片段直接结合,在sh RNA-Ctr/LS174T细胞中,Ascl2与CDX2启动子区域中-841~-646、-291~-134片段结合的DNA片段明显多于sh RNA-Ascl2/LS17T细胞。结论:1.荧光素酶报告基因表达载体p GL3-CDX2-C1~C8构建成功;2.Ascl2可能通过与CDX2启动子直接结合转录抑制结肠癌细胞中CDX2基因的表达。