研究背景和目的目前,肺癌仍是世界范围内肿瘤死亡的首要原因,其5年总生存率低于20%。在非小细胞肺癌中,腺癌是非吸烟者中发生率最高的类型,约占全部肺癌的40%以上,在我国其发病率呈逐年上升趋势,在美国等发达国家已超越鳞癌居首位。除了手术治疗,放化疗及靶向治疗是治疗肺腺癌的重要手段。在个体化治疗及精准医疗的大背景下,为了更好的治疗肺腺癌,延长肿瘤患者的生存时间,肺癌的个体化治疗方案也在不断改进和更新,但是,肺腺癌作为异质性很高的恶性肿瘤,有相当比例的患者对药物治疗或放疗不敏感,甚至出现抵抗。如何提高肺腺癌药物治疗及放射治疗的敏感性,仍是目前研究的热点和难题。EPSH家族是一类新型膜转运调控蛋白,可以参与胞膜转运的各个步骤,并起调控作用。EPSH主要定位于胞膜,除参与膜转运调控外,也具有有核质穿梭的功能,本课题组前期研究表明,EPSH在多个细胞系中可以调节多种膜蛋白的内吞和降解及DNA的损伤修复过程,虽然EPSH具有调控多种受体转运及其下游信号传导的特性,但是它在肺腺癌发生发展中的作用尚未完全明了,而EPSH与肺腺癌治疗敏感性的相关性更是知之甚少。首先我们分析手术肺腺癌患者临床病理信息,对比分析EPSH在正常肺组织和不同亚型肺腺癌组织的表达水平和组织定位情况,探讨EPSH水平及定位差异与肺腺癌患者复发转移及生存期的影响。应用EPSH表达水平不同的多种肺腺癌细胞系为模型,观察EPSH及其不同突变体对肺腺癌细胞增殖、迁移、药敏及成瘤性的影响,一方面验证肺腺癌中EPSH的野生型及不同突变体对表皮生长因子受体内吞转运及E钙黏蛋白的调控,另一方面探讨EPSH通过对DNA损伤修复因子的转运调控影响肺腺癌治疗敏感性的可能机制。研究方法:1.Western Blotting及免疫组化检测EPSH在肺腺癌组织及配对癌旁正常肺组织中的表达情况,比较其表达水平及定位差异,进一步分析EPSH表达定位与肺腺癌临床病理参数的相关性及生存分析,明确EPSH对肺腺癌患者无病生存期及总生存期的关系,并分析EPSH表达与E钙黏蛋白等表达的相关性。2.通过Western Blotting和免疫荧光技术分别验证内源性EPSH在多种肺癌细胞中的表达和定位情况。3.构建EPSH降表达,多种功能突变体及对照慢病毒表达质粒,感染A549细胞,用Western Blotting技术验证EPSH不同活性突变体对表皮生长因子受体,E钙黏蛋白等的表达情况及定位的影响。将EPSH不同突变体过表达和对照慢病毒表达质粒,感染PC9细胞,用Western Blotting技术验证EPSH过表达效果及对表皮生长因子受体,E钙黏蛋白等表达情况的影响。4.应用免疫荧光技术,激光共聚焦显微镜观察EPSH和表皮生长因子受体野生型及突变型的共定位状况,利用EGF刺激,观察二者定位情况5.二维克隆及划痕迁移实验,探讨EPSH及不同突变体对肺腺癌细胞增殖及运动能力影响。6.裸鼠体内成瘤实验,检测EPSH野生型及不同突变体对PC9细胞在BALB/C-nu鼠体内成瘤能力的影响。7.采用小剂量间歇诱导的方法建立肺腺癌顺铂耐药细胞系,并鉴定其耐药特性及生物学特性。8.免疫荧光检测耐药细胞与亲本细胞内EPSH的表达水平及定位情况,并检测药物耐受情况。9.应用Western Blotting检测耐药前后EPSH表达情况,同时建立EPSH降表达慢病毒,感染耐药细胞,Western Blotting技术检测EPSH降表达对耐药的影响。10.裸鼠体内成瘤实验,观察耐药细胞与亲本细胞成瘤性差异及对药物的敏感性。11.采用大剂量分割照射建立肺腺癌放射抵抗细胞系,并鉴定其放射抵抗特性及生物学特性。12.应用Western Blotting检测放射抵抗前后EPSH的表达情况及定位情况变化,同时建立EPSH降表达及核转运突变的慢病毒,感染耐放射细胞及亲本细胞,观察细胞放射敏感性变化,免疫荧光技术检测EPSH对P53B等DNA损伤修复相关蛋白定位及表达水平的影响。13.裸鼠体内成瘤实验,观察放射抵抗细胞与亲本细胞成瘤性差异,及对放射的敏感性差异。结果:1.免疫印迹检测发现,与癌旁正常肺组织相比,肺癌组织中EPSH表达水平明显下调;2.免疫组化检测发现,EPSH在正常肺组织呈胞膜表达,部分伴随胞浆表达,多数肺腺癌组织中EPSH呈阴性表达,而与正常肺组织相比,肺腺癌组织呈现胞核EPSH表达阳性但胞膜表达下降甚至消失的趋势。3.生存分析显示,EPSH总体表达量高预后较好,但未达到统计学差异,分层分析发现EPSH胞核高表达组5年DFS及OS均优于胞核低表达组(P=0.014&0.004),EPSH胞浆表达及间质表达对生存期无显著影响。多因素分析发现EPSH胞核高表达是影响肺腺癌手术患者术后复发转移及生存期的独立因素。4.EPSH胞核表达与E钙黏蛋白水平负相关,公认预后最差的以实性为主型腺癌更多出现EPSH核表达阴性(P=0.038)。5.A549细胞中EPSH的表达呈中等水平,而PC9细胞中EPSH表达很弱。A549细胞EPSH主要定位于胞膜、胞浆,而PC9细胞中表皮生长因子受体及E钙黏蛋白表达水平较高,因此将二者作为研究对象。6.激光共聚焦显微镜观察显示,在A549细胞中,EPSH和表皮生长因子受体存在共定位,EGF刺激条件下,这一现象更为明显。7.成功构建EPSH膜转运相关的不同功能结构域突变体,其参与表皮生长因子受体等膜蛋白的内吞转运过程。8.通过EGF刺激或导入表皮生长因子受体的激活突变体,均存在EPSH参与的转运调控。9.体内外实验证实EPSH不同突变体可以影响肺腺癌细胞的增殖,迁移能力及体内成瘤能力,并且可以影响对化疗药物及放射的敏感性。10.小剂量间歇诱导法建立成功两株肺腺癌耐药细胞株,与亲本细胞相比,耐药细胞形态发生改变,表现为由多边形变为梭形,耐药株二维克隆形成能力减弱,生长缓慢,耐药相关蛋白表达上调,EMT指标明显改变,呈间质细胞表型。细胞耐药后,EPSH表达上升。11.耐药细胞EPSH表达明显升高,降表达EPSH后,耐药水平明显下降。12.进一步体内外实验证实,降表达EPSH后,耐药细胞对顺铂的敏感性增加。13.应用常规剂量和超分割大剂量照射建立放射抵抗细胞株,经过多次反复照射,A549,PC9等对放射敏感程度明显下降,放射抵抗细胞二维克隆能力明显减弱,成瘤能力明显减弱,但对放射的敏感性明显下降。13.照射处理后,多种肺腺癌细胞EPSH水平明显上调,表皮生长因子受体水平升高,EMT相关指标明显改变,放射抵抗细胞株形态向“间质细胞”形态变化。14.体内外实验证实放射抵抗细胞感染EPSH不同突变体以及降表达质粒后,对射线的敏感性明显改变;15.EPSH及其入核突变体可以影响DNA损伤因子P53B的入核过程,从而影响放射抵抗细胞的放射敏感性。结论:1.与正常肺组织相比,EPSH在肺癌组织中明显下调,并呈现以胞核表达为主,胞膜表达减少的趋势;EPSH核表达影响肺腺癌患者生存和远处转移。2.在肺腺癌细胞系中,EPSH不同结构域突变调控表皮生长因子受体,E钙黏蛋白等转运及细胞增殖及侵袭迁移,不同突变体影响体内肿瘤的形成。3.耐药细胞中EPSH表达明显上调,降表达后耐药性下降,表明其参与肺腺癌的耐药,其机制尚待进一步研究。4.EPSH不仅具有膜转运功能,而且具有核功能,其调控损伤修复因子P53B入核过程可以参与肺腺癌的放射抵抗;5.EPSH作为新型膜转运蛋白,及其膜蛋白转运功能及核功能可能是参与调控肺腺癌发生发展以及耐药及放射抵抗,其复杂的肿瘤生物学作用尚待更深入的研究。