研究背景结缔组织病(connective tissue disorders,CTDs)是一类通过自身免疫反应导致机体损伤的疾病,这类疾病几乎可以累及全身各个器官。肺脏含有丰富的胶原纤维和血管,并具有免疫调节、代谢、内分泌等功能,是各种结缔组织病较易侵犯的脏器。结缔组织病引起的肺损害表现多样,其中较为常见的是肺间质病变,被称为结缔组织病相关肺间质病变(interstitial lung disease with connective tissue disorders,CTD-ILD)。其病理改变早期主要是渗出性病变为主的肺泡炎,随着病情进展,胶原广泛沉积,最终导致不可逆性肺间质纤维化及肺功能损害。结缔组织病相关肺间质病变的病理类型复杂,所有肺间质病变的病理类型都可存在于CTD-ILD中,而且可同时并存于同一患者,CTD-ILD的病理类型目前公认的是采用2002年由ATS和ERS推荐的肺间质病变的分类标准。CTD-ILD的发病率高、死亡率高,缺乏统一规范的治疗手段,最常使用的激素和环磷酰胺等治疗方法易继发感染,使该并发症成为目前临床研究的难点和热点。本实验着重对结缔组织病所致肺间质病变的病理进行分析,探索病理类型与原发病、影像学、治疗方案、肺功能、炎症指标等因素之间的关系,以期对临床全面认识和治疗CTD-ILD提供依据；同时在体外探讨肺纤维化的部分机制。小窝蛋白-1(caveolin-1)是21-24Kda大小的细胞膜嵌蛋白,在体内是小窝蛋白的主要组成成分,具有参与胞膜转运、胆固醇运输、脂类稳定及细胞信号转导等多种生物学功能。已有研究表明小窝蛋白-1与肺纤维化有关,故本实验对小窝蛋白-1在结缔组织病相关肺间质病变中的表达及其在TGF-β1诱导的人肺成纤维细胞中的表达调控进行初步研究,以期更深入了解它在结缔组织病相关肺间质病变发病机制中的作用,并为寻找新的治疗靶点提供帮助。近年来有研究表明CTD-ILD与特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)具有相似的病理特征,即有大量由肌成纤维细胞(myofibroblast,MF)组成的成纤维细胞灶存在,而MF具有分泌多种细胞因子,造成细胞外基质的异常沉积,以及诱导肺泡上皮细胞的凋亡等作用。TGF-β1能诱导人肺成纤维细胞(human lung fibroblast,HLF)转化为肌成纤维细胞,可见其对肺纤维化的促进作用。目前临床上治疗CTD-ILD最常用的药物是甲强龙(Sou-Medrol,MP)和环磷酰胺(cyclophosphamide,CTX),但是其机理还不太明晰,本实验拟通过体外观察MP和CTX对HLF增殖及其对TGF-β1诱导HLF分化为MF的影响,探讨MP和CTX对CTD-ILD的作用机制,为临床治疗CTD-ILD提供理论依据。研究目的和意义1.了解CTD-ILD的病理类型与原发病、穿刺部位影像学表现、肺功能、治疗方案、炎症指标等之间的相互关系。2.了解小窝蛋白-1在CTD-ILD患者肺组织中的表达,并在体外对其在肺纤维化中的作用进行探讨。3.通过体外实验,探讨甲强龙与环磷酰胺对TGF-β1诱导的HLF向MF转化的影响。研究方法1.对2003年1月至2010年12月于广东省人民医院风湿科住院诊断为CTD-ILD并行CT引导下经皮肺穿刺活检的45例患者进行回顾性分析。将病理类型分为寻常型间质性肺炎(usual interstitial pneumonia, UIP)、非特异性间质性肺炎(nonspecific interstitial pneumonia, NSIP)及其它型三种,将治疗方案分为CTX<12g、CTX≥12g、非CTX三组,将治疗效果分为好转、稳定、恶化及无法判定四组,记录穿刺部位的高分辨CT (high resolution computerized tomography,HRCT)影像学表现、治疗方案及治疗前后血沉(erythrocyte sedimentation rate, ESR)、C反应蛋白(C-reactive protein, CRP)、血小板(platelets, PLT)、用力肺活量(forced vital capacity, FVC)、一秒用力呼气容积(forced expiratory volume in one second, FEV1)、一氧化碳弥散量(diffusion capacity for carbonmonoxide of lung, DLCO)、氧分压(partial pressure of oxygen, PO2)、二氧化碳分压(partial pressure of carbondioxide, PCO2)、氧饱和度及肺部感染发生情况。分析CTD-ILD病理类型与原发病、穿刺部位HRCT表现、炎症指标、肺功能、动脉血气分析、治疗等之间的关系。2.CTD-ILD患者及正常肺组织的冰冻切片进行HE染色鉴定后,行小窝蛋白-1、TGF-β1免疫双荧光染色；正常肺组织行原代成纤维细胞培养、鉴定,加入10μg/L TGF-β1诱导HLF 24小时,比较诱导前后小窝蛋白-1荧光表达变化；选用11-20代HLF,以终浓度分别为0、1、3、5、10、15μg/L的TGF-β1诱导24h以及浓度为10μg/L TGF-β1分别诱导0、6、12、24、48h,用荧光定量PCR及Western Blot方法检测小窝蛋白-1mRNA及蛋白表达变化。3.体外培养原代HLF并传代,用11-20代细胞进行以下实验：以10μg/LTGF-β1诱导HLF向MF转分化。应用四甲基偶氮唑盐法检测甲强龙和环磷酰胺对HLF的增殖抑制率,用SPSS软件得出两药IC50值作为细胞单独用药浓度；以此为依据分为：PBS对照组(阴性对照组)、TGF-β1组(10μg/L)(阳性对照组)、TGF-β1+甲强龙组(MP组),TGF-β1+环磷酰胺组(CTX组)、TGF=β1+甲强龙±环磷酰胺组(联合用药组)。各组作用于HLF 24h,应用Western Blot方法检测各组α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达。4.统计分析：采用SPSS13.0软件进行统计分析。临床研究：定量资料的描述用均数±标准差,分类资料的描述用构成比及相应人数；组间比较采用单因素方差分析,两组定量因素的前后水平差异比较用配对t检验,多组分类因素构成比的差异比较用卡方检验；不满足参数检验的统计分析采用Kruskal Wallis非参数检验,两分类变量的关联程度用列联相关系数表示,分类资料的对应关系用对应分析。基础研究：组间比较采用单因素方差分析,经Levene方差齐性检验,方差齐时采用LSD法进行多重比较；方差不齐时用Welch近似方差分析,用Dunnett’s T3法进行多重比较。P<0.05为差异有统计学意义。研究结果：1.入选的45例患者包括系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)7例、原发性干燥综合征(primary Sjogren syndrome,pSS)11例、多发性肌炎(polymy olitis,PM)3例、皮肌炎(dermatomylsitis,DM)5例、系统性硬化症(systemic sclerosis,SSc)8例、类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA) 3例、韦格纳肉芽肿(Wegener’s Granulomatosis,WG)4例、混合型结缔组织病(mixed connective tissue disease,MCTD)2例、抗合成酶抗体综合征(anti-synthetase syndrome,ASS)及复发性多软骨炎(relapsing polychondritis,RP)各1例。病理类型的原发病构成不同(P=0.013), SLE、pSS、PM、DM对应的病理类型主要是NSIP, ASS、MCTD、RA的病理类型主要表现为UIP, SSc、RP、WG对应的病理类型主要为其它型。病理类型与穿刺部位HRCT影像学表现相关(r=0.545, P=0.043), UIP对应的穿刺部位HRCT表现主要为网格影、磨玻璃影,NSIP对应的主要为斑片影,蜂窝影、结节影的病理类型主要为其它型,实变影的病理类型则表现在3种均可。三种病理类型的炎症指标有不同程度的升高,但它们之间的差异无统计学意义,不同病理类型间的肺功能及动脉血气分析结果差异均无统计学意义。治疗方面,不同病理类型间的治疗效果无统计学差异(P=0.849),发生肺部感染的机会也基本相同(P=0.863)。但不同治疗方案间治疗效果的差异有统计学意义(P=0.005),从好转及稳定百分比看,CTX≥12g组要优于CTX<12g及非CTX组。随访期间有51.1%患者发生肺部感染,有3名患者因此死亡,其中2例为NSIP、1例为未定型。2.HE染色结果显示：正常对照组肺组织肺泡、肺间隔结构清晰,无炎症细胞浸润、肺泡间隔增厚等异常病理改变；而CTD-ILD患者组可见肺间隔断裂或增厚、炎症细胞浸润、肺泡腔内分泌物渗出等病理改变。免疫双荧光染色结果显示：小窝蛋白-1、TGF-β1共同表达于肺间质中,与对照组相比,CTD-ILD患者肺组织TGF-β1表达增强,而小窝蛋白-1表达减弱。小窝蛋白-1在HLF的胞膜上表达丰富,经TGF-β1诱导可使其表达减弱,且呈现一定的浓度和时间依赖趋势。与TGF-β10μg/L(对照组)相比,小窝蛋白-1mRNA表达在5、10、15μg/L TGF-β1组均下降,差异均有统计学意义(P值均<0.01)；而小窝蛋白-1的蛋白表达仅在10、15μg/L TGF-β1组有减少,差异有统计学意义(P值均<0.01)。以TGF-β1作用Oh组为对照,小窝蛋白-1mRNA表达在TGF-β1作用6h、12h、24h、48h组均有下降,差异均有统计学意义(P值均<0.01)；而小窝蛋白-1蛋白表达则在TGF-β1作用24h、48h组下降,差异有统计学意义(P值均<0.01)。3.甲强龙和环磷酰胺可以抑制HLF的增殖,并呈现一定的浓度依赖关系,两药的单独用药浓度分别取10-3mg/ml和10-5mg/ml。结果表明10μg/L的TGF-β1诱导HLF 24h后,a-SMA蛋白表达较PBS对照组增多,差异有统计学意义(P <0.001)。TGF-β1与单药MP或CTX共培养24小时后发现：与PBS阴性对照组相比,两单药组a-SMA的表达均有增加,差异有统计学意义(P=0.003、0.020)；但与TGF-β1阳性对照组相比,两单药组a-SMA的表达有所下降,差异有统计学意义(P=0.024、0.003)；与联合用药组比较,发现两单药组a-SMA的表达下降不及联合用药组明显,差异有统计学意义(P值分别<0.001、0.001)。但MP及CTX单独用药组之间a-SMA的表达差异无统计学意义(P=0.327)。联合用药组a-SMA的表达与PBS对照组间差异无统计学意义(P=0.207),与TGF-β1对照组、TGF-β1+MP组、TGF-β1+CTX组相比均有显著下降,差异均有统计学意义(P值分别为<0.001、<0.001、0.001)。结论：1. CTD-ILD患者的病理类型与原发病、穿刺部位HRCT表现相关,不同病理类型间炎症指标、肺功能、动脉血气分析、治疗效果以及肺部感染发生机率的差异均无统计学意义；不同治疗方案间治疗效果差异有统计学意义,CTX≥12g组要优于CTX<12g及非CTX组。2.CTD-ILD患者肺组织中的TGF-β1表达增强,小窝蛋白-1表达减少；TGF-β1诱导可使HLF胞膜上的小窝蛋白-1表达减弱,并呈现一定的浓度和时间依赖趋势,且蛋白的表达滞后于mRNA的表达,表明TGF-β1诱导的小窝蛋白-1表达下降可能参与了CTD-ILD的发生和发展。3.甲强龙与环磷酰胺能够抑制TGF-β1诱导的HLF向MF的转化,两药联合应用的抑制作用优于两药单独应用。