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龋齿是一种发生率很高的口腔疾病，由于目前常用的干预龋齿的方法、制剂等都存在一定的缺陷，促使人们希望从天然产物中寻求新的高效、无毒副作用的干预龋齿的活性成分。据研究报道，植物多酚类化合物能够有效保护口腔健康，而原花青素是以儿茶素或表儿茶素为结构单元缩合而成的多酚类聚合物，其对龋齿的干预效果比如今公认的抗龋制剂茶多酚更好，但是关于原花青素干预致龋菌在牙齿表面粘附的途径和作用机制尚未研究清楚。变形链球菌（Streptococcus mutans，S.mutans）作为口腔中最主要的致龋齿菌之一，其在牙面上的粘附和定植是龋齿发生的关键，而粘附的实质则是致龋齿菌表面粘结素与牙齿表面唾液获得性膜上的受体蛋白相互作用的结果。葡糖基转移酶(GTFs)和葡聚糖结合蛋白(GBPs)是S.mutans产生的重要致龋毒力蛋白，且两者是S.mutans表面粘结素中的主要成分。GTFs在S.mutans（Ingbrittc）中主要分为三种，分别是GTFB，GTFD和GTFC，其中GTFB能够催化蔗糖产生水不溶性葡聚糖，这一过程对S.mutans在牙面粘附形成菌斑至关重要，gtfB的基因全长约为4.8 kb，其中位于N端的催化活性区(CAT)是gtfB三个功能区段中最重要的区段。S.mutans(Ingbritt c)有4种GBPs，分别是GBPA、GBPB、GBPC和GBPD。GBPB是S.mutans在牙齿表面粘附与聚积的“桥梁”，其除了具有结合葡聚糖的功能之外，还可能与S.mutans细胞壁的形成以及其肽聚糖水解酶的活性相关。本文将从高粱外种皮中分离得到的原花青素四聚体作为研究干预龋齿的天然活性成分，通过基因克隆表达技术分别得到高纯度、高活性的GTFB/CAT蛋白和GBPB-sumo蛋白，并采用荧光猝灭、紫外-可见吸收光谱和圆二色谱三种常见的光谱学技术研究GTFB/CAT和GBPB-sumo两种蛋白分别与SPC四聚体相互作用前后的结构及活性变化，期望揭示SPC四聚体分别与GTFs和GBPs相互作用并干预S.mutans在牙齿表面粘附的作用机制。本研究主要内容包括： ⑴高粱外种皮中原花青素四聚体的分离及鉴定。采用RP-HPLC-ESI-MS/MS对SPC-Ⅵ级分进行鉴定，分析结果表明SPC-Ⅵ级分主要由原花青素四聚体组成。 ⑵葡萄糖基转移酶B催化活性区的基因克隆及表达。根据NCBI上公布的Streptococcus mutans UA159(Ingbrittc)gtfB的cDNA序列，按照其两端序列设计引物，采用PCR克隆技术钓取S.mutans UA159的gtfB/CAT基因，PCR产物经测序鉴定后连接表达载体pET-28b(+)，将重组体pET-28b(+)-GTFB/CAT转入大肠杆菌BL21中进行诱导表达，比较发现当诱导剂异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的浓度为1mmol/L时，在37℃或30℃下诱导4h表达效果更好。表达产物经Ni2+-NAT树脂亲和层析纯化得到不可溶的GTFB/CAT包涵体蛋白，并经变性-复性恢复其可溶性，最终产物经SDS-PAGE鉴定其纯度约为80％，Somogyi法测得GTFB/CAT蛋白的酶活和比酶活分别为131.67 mIU和1.66 IU/mg。将通过基因克隆表达得到的蛋白经Nano LC-MS/MS鉴定，其中包含3种可信蛋白，均来自Streptococcus mutans serotype C(Strain ATCC700610/ua159)，得分最高的来源于gtfB的蛋白为目标蛋白。 ⑶葡萄糖结合蛋白B的基因克隆与表达。根据NCBI上公布的S.mutans UA159(Ingbrittc)gbpB的cDNA序列，按照大肠杆菌的偏好优化密码子并在体外进行gbpB全基因的合成。将经测序鉴定的PCR克隆产物连入pET-28a-sumo表达载体，将重组表达质粒pET-28a-sumo-gbpB转化至表达感受态细胞Rosetta(DE3)中，在IPTG的浓度为0.5 mmol/L，37℃，158 r/min条件下诱导3h。将表达得到的蛋白上清液和蛋白沉淀分别经SDA-PAGE检测，在表达上清液中发现目标蛋白，将裂解的蛋白上清液用Ni2+-NTA亲和层析纯化后经SDS-PAGE检测，得到蛋白纯度约为90％。将基因克隆得到的GBPB-sumo蛋白经Nano LC-MS/MS鉴定，其中3种可信蛋白均来源于Streptococcus mutans serotype C(Strain ATCC700610/ua159)，得分最高的来源于gbpB的蛋白为目标蛋白。 ⑷三种光谱学方法研究SPC四聚体分别与GTFB/CAT和GBPB-sumo蛋白相互作用的机理。Somogyi法测得GTFB/CAT蛋白与SPC四聚体相互作用前后的酶活值分别为131.67mIU和7.59 mIU，酶活降低了94.24％，表明SPC四聚体和GTFB/CAT蛋白相互作用后抑制了其酶活。通过荧光猝灭分析得到，SPC四聚体对GTFB/CAT蛋白、GBPB-sumo蛋白的Stern-Volmer猝灭常数KSV分别为2408.1 M-1和2346.6 M-1，猝灭速率常数kq分别为2.4081×1011M-1·s-1和2.3466×1011 M-1·s-1，同时SPC四聚体与两种蛋白之间的结合常数KA分别为1522.6M-1和2618M-1，结合位点数n均为1，根据荧光猝灭发生机理推断SPC四聚体与GTFB/CAT蛋白、GBPB-sumo蛋白之间形成了不发荧光的复合物，猝灭方式是单一的静态猝灭。GTFB/CAT蛋白和GBPB-sumo蛋白的紫外图谱随着SPC四聚体浓度的增大也发生改变，其吸光强度均随着SPC四聚体浓度的增大而发生明显地变化，且最大吸收峰的位置发生了不同程度的红移，说明SPC四聚体对蛋白质中芳香族氨基酸残基所处的微环境造成了影响。紫外-可见吸收光谱的结果进一步说明了SPC四聚体对GTFB/CAT蛋白、GBPB-sumo蛋白均是单一的静态猝灭过程。经圆二色光谱分析发现GTFB/CAT蛋白和GBPB-sumo蛋白的二级结构均因与SPC四聚体的结合而发生改变，其中GTFB/CAT蛋白的二级结构中不含β-转角，随着SPC四聚体的浓度不断增大，α-螺旋和无规则卷曲结构的百分比逐渐下降至0.00％，β-折叠的百分比则均增加至100.00％。GBPB-sumo蛋白的二级结构除了与GTFB/CAT蛋白有相似的结构变化外，其二级结构中的β-转角的百分比也减小至0.00％。由此推断SPC四聚体与两种蛋白之间均发生了结合，使蛋白内维持结构稳定性的氢键遭到破坏，且其内部疏水区域的一些氨基酸残基可能被暴露出来，从而导致蛋白的二级结构发生改变。SPC四聚体使两种致龋蛋白结构或活性发生改变，从而影响了S.mutans在牙面获得性膜上的粘附和定植，进一步干预龋齿的发生。