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目的本实验通过建立大鼠大脑中动脉脑缺血再灌注模型，并运用Cathepsin D抑制剂pepstatin A对其进行干预，检测Cathepsin D和pMLK3的蛋白表达变化，探讨Cathepsin D与MLK3在大鼠脑缺血再灌注损伤过程中神经细胞凋亡的关系，为研究溶酶体参与脑缺血再灌注损伤神经细胞凋亡提供新的探索，为缺血性脑血管病提供新的治疗靶点。方法67只清洁级健康雄性Sprague-Dawley大鼠，体重280±20g，随机分为3组：假手术组（sham，n=7），模型组（M，n=30），干预组（I，n=30）：于再灌注前及再灌注后每12h腹腔注射溶酶体Cathepsin D抑制剂pepstatin A2ml/100g（而假手术组及模型组于相应时间腹腔注射生理盐水2ml/100g）。其中模型组和干预组又分为2小时组（M-2h，n=6；I-2h，n=6），6小时组（M-6h，n=6；I-6h，n=6），24小时组（M-24h，n=6；I-24h，n=6），48小时组（M-48h，n=12；I-48h，n=12）。应用改良的Long线栓法制作大鼠大脑中动脉脑缺血再灌注模型，缺血2小时后恢复再灌注，使用Longa’s的5级评分法评价神经功能；使用TTC染色法、TUNEL凋亡检测法及免疫组织化学方法，分别检测脑梗死体积、细胞凋亡数量、CathepsinD与pMLK3的表达变化。结果1.模型成功率76.14%；模型组48小时相对脑梗死体积为37.36±1.44%，干预组48小时相对脑梗死体积为27.49±2.30%。2.假手术组脑组织未见梗死灶，模型组和干预组缺血侧皮质及皮质下可见白色梗死灶，但干预组48小时相对梗死体积较模型组减少（p=0.000），且干预组神经功能缺损评分较模型组也得到明显改善（p<0.05）。3.大鼠脑缺血侧皮质区，假手术组凋亡细胞很少，模型组2小时可以观察到凋亡细胞，6小时、24小时、48小时呈上升趋势（p<0.001）；干预组2小时凋亡细胞较模型组2小时无显著改变（p=0.127），干预组6小时、24小时、48小时观察到的凋亡细胞较模型组明显减少（p<0.05）。4.大鼠脑缺血侧皮质区，假手术组可见少量Cathepsin D的表达，模型组Cathepsin D的表达在再灌注2小时、6小时、24小时呈上升趋势，24小时达高峰，48h组较24h组有所下降，但仍居高水平，均比假手术组高（p=0.000）；干预组各时间点Cathepsin D的表达较模型组明显减少（p=0.000）。5.大鼠脑缺血侧皮质区，假手术组pMLK3少量表达，模型组pMLK3的表达在再灌注2小时即有大量表达，于6小时达高峰，之后逐渐下降，均高于假手术组（p=0.000）；干预组各时间点pMLK3的表达均较模型组明显减少（p<0.05）。结论1.大鼠脑缺血再灌注损伤过程中溶酶体Cathepsin D可能通过上调MLK3的磷酸化而介导神经细胞凋亡。2.Pepstatin A可能通过抑制Cathepsin D而下调MLK3的磷酸化活性表达，从而减少细胞凋亡，减少脑梗死体积，起到神经保护作用。